CARATTERISTICHE GENERALI DEI PEPTIDI ANTIMICROBICI

Durante gli ultimi dieci anni sono stati isolati moltissimi peptidi biologicamente attivi da un’ampia gamma di organismi comprendenti batteri, piante, insetti, anfibi e mammiferi. Questi peptidi svolgono un ruolo molto importante nei sistemi di offesa e di difesa dei diversi organismi. Pur variando considerevolmente nel numero di residui, che va dai 10 ai 40 aminoacidi, essi presentano delle caratteristiche comuni: sono infatti peptidi cationici e di natura anfipatica in grado di interagire con la membrana cellulare e di distruggerne le normali funzioni. La loro sintesi è di tipo ribosomiale, a differenza di quella degli antibiotici classici realizzati da funghi e procarioti che comprende una serie di passaggi successivi catalizzati ognuno da un enzima particolare. Essi derivano da prepropeptidi di circa 60-170 aminoacidi, rilasciati in forma matura da specifiche proteasi.

La maggior parte dei precursori contiene:

-una sequenza segnale per il reticolo endoplasmatico;

-una prosequenza anionica di lunghezza variabile, che avrebbe la funzione di neutralizzare le cariche positive del peptide rendendolo inattivo;

-la sequenza del peptide maturo.

La pelle di anfibio si è rivelata una ricca sorgente di tali peptidi con funzioni sia fisiologiche che difensive. Tali componenti sono prodotte e secrete da ghiandole granulari controllate da nervi simpatici che scaricano il loro contenuto sul dorso dell’animale in risposta ad una varietà di stimoli.

Alcuni di questi peptidi sono farmacologicamente attivi come le caeruleine, le tachichinine, le bradichinine ed i peptidi oppioidi; per molti di questi sono state trovate controparti nel cervello e nel tratto intestinale dei mammiferi. E’ stato ipotizzato che tali peptidi possano avere un ruolo nella regolazione dell’equilibrio elettrochimico a livello dell’epitelio di questi anfibi oltre che di difesa contro predatori e microorganismi.

L’importanza dello studio dei peptidi antimicrobici è accresciuta dai fenomeni di resistenza ai tradizionali antibiotici che sempre maggiormente si verificano oggigiorno, dovuti ad un uso improprio degli stessi. Nei confronti di questi peptidi, infatti, fino ad ora non si sono verificati fenomeni di resistenza.

PEPTIDI COME FATTORI DEL SISTEMA IMMUNITARIO INNATO

Gli organismi viventi si difendono dall’invasione di agenti estranei mediante due tipi di risposte: un’immunità cosiddetta "innata o naturale" e una "acquisita o clonata".

Quest’ultima è l’espressione di una stato di resistenza dell’individuo all’azione di agenti estranei (antigeni) che si sviluppa in seguito al loro contatto con l’organismo ospite. Le sue caratteristiche fondamentali sono la specificità, dovuta agli anticorpi prodotti dalle plasmacellule, e la memoria, dovuto al clone di cellule memoria che serva a prevenire successive infezioni, rendendo la risposta più forte e rapida.

L’immunità innata rappresenta invece un meccanismo di difesa preesistente all’incontro con l’antigene: esso si avvale di diversi fattori meccanici e chimici (cute, saliva, secrezione gastrica), umorali (lisozima, complemento, interferone), di cellule (fagociti) e della flora batterica commensale. I peptidi antimicrobici rappresentano un’ulteriore via di risposta innata alle infezioni microbiche.

Il sistema innato è caratterizzato da:

-assenza di specificità, in quanto è attivo contro un largo spettro di microorganismi;

-assenza di memoria;

-velocità di risposta, dovuta all’immediata disponibilità dei peptidi immagazzinati ed alla loro rapida sintesi e diffusione;

-assenza di un meccanismo di riconoscimento del "self": l’autodistruzione è evitata dalla compartimentalizzazione cellulare dei peptidi che sono conservati in granuli con membrane resistenti e/o sotto forma di propeptidi;

-basso costo energetico, in quanto i peptidi necessitano per la sintesi di una quantità di energia inferiore a quella richiesta all’animale per la complessa attivazione dell’immunità clonata.

Questo sistema immunitario è stato dapprima scoperto nell’emolinfa di insetti quali la Hyalophora cecropia da cui deriva la Cecropina; sono stati poi scoperti peptidi analoghi in altri insetti e in numerose specie di anfibi. Negli insetti tale sistema è indotto in risposta ad un’infezione microbica, mentre negli anfibi la produzione di peptidi è costitutiva, anche se vengono rilasciati in risposta ad uno stimolo esterno.

Un sistema simile è stato trovato anche nei mammiferi dove le defensine, una famiglia di peptidi a largo spettro di attività antimicrobica, sono immagazzinate in granuli citoplasmatici dei neutrofili e nelle cellule di Paneth dell’intestino tenue.

L’immunità innata dal punto di vista evolutivo deve essersi sviluppata più precocemente rispetto a quella acquisita, più complessa e più finemente regolata. Questo sistema di difesa innato, infatti, è l’unico a disposizione dei phyla inferiori (artropodi ed insetti). Negli organismi superiori invece il sistema innato funge da sistema di difesa complementare a quello cellulo-mediato contro patogeni occasionali ed obbligati e contro la proliferazione della flora batterica naturale.

MECCANISMO D’AZIONE

Molti di questi peptidi agiscono alterando direttamente la membrana delle cellule bersaglio: l’interazione di tali molecole con un qualche recettore chirale di membrana sembra infatti esclusa, dal momento che analoghi di questi peptidi costituiti da tutti enantiomeri D sono attivi quanto quelli naturali.

Le membrane batteriche sono ricche di fosfolipidi anionici, come la fosfatidilserina ed il fosfatidilglicerolo: ciò determina quindi un’interazione elettrostatica del peptide carico positivamente con la membrana stessa, che è alla base del successivo effetto di perturbazione del doppio strato. La differente composizione delle membrane è infatti alla base della selettività che alcuni di questi peptidi hanno per le cellule batteriche. Le cellule eucariotiche, come ad esempio gli ematociti, sono caratterizzate da un alto contenuto di fosfolipidi zwitterionici, come la fosfatidilcolina, la sfingomielina e la fosfatidiletanolammina; sono inoltre ricche di colesterolo, assente nei batteri, che sembra inibire l’azione di tali peptidi conferendo una certa resistenza alle membrane. Un altro fattore importante per la selettività è il valore del potenziale di membrana: un potenziale più negativo all’interno della cellula, tipico delle cellule batteriche (100-150 mV), facilita l’interazione del peptide con lo strato lipidico.

Nel caso di batteri Gram-negativi è stato visto che inizialmente il peptide interagisce con le molecole polianioniche di lipopolisaccaride della membrana esterna ed è poi in grado di permeabilizzarla o di essere captato all’interno. Nel caso dei batteri Gram-positivi il peptide è invece probabilmente attratto dagli acidi teicoici e teicuronici e da altri gruppi anionici che si trovano esternamente allo strato di peptidoglicano.

Sono stati proposti due principali meccanismi generali per spiegare l’effetto conseguente all’interazione dei peptidi con la membrana citoplasmatica:

-un effetto "detergente", in cui la struttura anfipatica di tali molecole interagirebbe con il doppio strato lipidico, distruggendone l’organizzazione e determinando la fuoriuscita dei componenti citoplasmatici;

-la fomazione di canali dovuta all’aggregazione dei monomeri di peptide nel doppio strato lipidico.

Il primo meccanismo è supportato da evidenze di permeabilizzazione del doppio strato in assenza di potenziale di membrana, dall’ alta stechiometria di peptide richiesta per ottenere la lisi, in contrasto con lo scarso numero di molecole richiesto per la formazione di canali, e da studi strutturali che mostrano come alcuni peptidi adottino prevalentemente una posizione parallela al piano della membrana.

La formazione di un "poro" è stata invece supposta dalla presenza di effetti cooperativi tra peptidi e dal posizionamento perpendicolare del peptide nella membrana. In alcuni casi è stato proposto un processo in cui il peptide, dopo aver inizialmente ricoperto la membrana con uno strato orientato parallelamente alla superficie, si inserirebbe perpendicolarmente all’interno una volta raggiunta una elevata concentrazione.

Vi sono comunque delle eccezioni al meccanismo generale d’azione sulla membrana: la buforina II, isolata dal Bufo bufo, è in grado di penetrare nella cellula e di inibire la funzioni cellulari legandosi al DNA e all’RNA (Park et al.,1998). Anche i peptidi ricchi in prolina ed arginina agiscono solitamente in modo differente, in quanto un’alta concentrazione di prolina è incompatibile con la formazione di una struttura anfipatica.

CLASSIFICAZIONE DEI PEPTIDI ANTIMICROBICI

I peptidi antimicrobici si possono dividere per composizione e per struttura secondaria in tre gruppi principali:

-peptidi contenenti cisteine, che formano nella maggior parte dei casi ponti disolfuro; si distinguono due sottoclassi:

a) peptidi contenenti più ponti disolfuro che adottano una struttura a foglietto b antiparallelo (defensine, tachiplesine);

b) peptidi con struttura a loop contenenti un solo ponte disolfuro (bactenecine, brevinine, esculentine);

-peptidi che contengono un’alta percentuale di aminoacidi specifici (PR-39, apidecina ed i peptidi bovini ricchi in prolina e arginina Bac5 e Bac7);

-peptidi lineari che si strutturano ad a -elica in ambiente idrofobico e che assumono struttura random in soluzione; questo è il gruppo più numeroso e più a fondo studiato, a cui appartengono la maggior parte dei peptidi antimicrobici "classici" e di cui si conoscono moltissimi esempi (cecropine, melittina, magainine, dermaseptine, temporine, bombinine).

PEPTIDI CON STRUTTURA A b FOGLIETTO

DEFENSINE

Le defensine sono peptidi immagazzinati nei granuli citoplasmatici dei neutrofili di mammifero (topo, ratto, coniglio, uomo) e nelle cellule di Paneth dell’inestino tenue.

Le a -defensine sono costituite da 29-30 aminoacidi con elevato contenuto di arginina e sei residui di cisteina, le cui posizioni sono conservate all’interno della famiglia. Queste molecole sono accumulate nei granuli dei neutrofili in forma attiva e sono rilasciate nei vacuoli fagocitici. I neutrofili hanno la capacità di fagocitare e distruggere l’agente invasore: questi peptidi costituiscono quindi un meccanismo ausiliario all’uccisione "ossigeno dipendente" di cui sono responsabili i leucociti.

Dai neutrofili bovini è stato isolato un gruppo di 13 defensine, le b -defensine, lunghe 38-42 residui contenenti sempre 6 cisteine in posizioni conservate, ma diverse dalle a -defensine. Simile a questi peptidi è anche il peptide antimicrobico tracheale (TAP) isolato dagli epiteli delle vie aeree bovine.

Le defensine sono peptidi compatti, globulari formati in maggior parte da 3 foglietti b antiparalleli senza a elica; i 3 ponti disolfuro conferiscono una certa rigidità alla struttura. La defensina umana HNP-3 in cristalli forma dei dimeri a forma di cesto la cui base è idrofobica , mentre i bordi contengono le catene polari dell’N- e del C-terminale. Nonostante la differenza strutturale con i classici peptidi che formano canali, anche le defensine sono in grado di formare pori multimerici e di indurre così la lisi di vescicole lipidiche tramite un meccanismo di tipo "tutto o nulla". L’anfipaticità è dunque una caratteristica molto conservata, anche nel caso di strutture tridimensionali diverse dalla classica a elica: questo dimostra la sua importanza per l’interazione con la membrana. Il fatto che peptidi di così diversa composizione e struttura agiscano in modo simile, fa pensare che tali molecole possano essere il prodotto di un’evoluzione convergente.

TACHIPLESINE

Sono una famiglia di piccoli peptidi di 17-18 residui sintetizzati dagli emociti del crostaceo giapponese Tachypleus tridentatus ed immagazzinati nei granuli di queste cellule. Dati di NMR hanno suggerito una struttura a foglietto b antiparallelo stabilizzata da due ponti disolfuro tra i residui di cisteina 4-17 e 8-13. All’interno di tale struttura gli aminoacidi idrofobici sono localizzati su un lato del piano, mentre i sei residui cationici si trovano nella "coda" della molecola: l’anfipaticità è dunque conservata anche in questo caso.

Questi peptidi hanno attività contro funghi, batteri Gram-positivi e Gram-negativi. E’ stato visto che hanno la capacità di legare i lipopolisaccaridi della membrana esterna dei Gram-negativi tramite l’interazione dei 4 residui di arginina con i 2 gruppi fosforici del glicolipide del LPS: questo spiegherebbe la loro particolare efficacia contro questi batteri.

PEPTIDI CON UN SOLO PONTE DISOLFURO

BACTENECINA

E’ isolata dai neutrofili bovini ed è lunga 12 residui. Ha una struttura ad ansa mantenuta da un ponte disolfuro ed è attiva contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi. Ha anche attività citotossica sulle cellule neuronali e gliali.

BREVININE

Le brevinine-1 e 2 sono peptidi basici isolati dalla pelle della rana coreana Rana brevipoda porsa e in seguito dalla pelle di Rana esculenta. Questi peptidi possiedono una cisteina all’estremità C-terminale che forma un ponte disolfuro con una seconda cisteina posta sei residui a monte: le sequenza ivi compresa è caretteristica per ciascuna classe. La porzione N-terminale di queste molecole assume una conformazione ad a elica anfipatica, mentre il ponte disolfuro forma un anello C-terminale.

Le brevinine-1 derivano da un precursore di 71 aminoacidi contenente una sola copia di un peptide di 24 residui. La struttura di tali molecole mostra analogie con quella della pipinina, un peptide isolato dalla pelle di Rana pipiens che induce il rilascio di istamina dai mastociti peritoneali di ratto.

Le brevinine-2 sono costituite da 28-30 aminoacidi e derivano da precursori di 68-74 residui.

Le brevinine hanno attività sia contro batteri Gram-positivi che Gram-negativi. Le brevinine-1 mostrano attività anche contro alcuni lieviti, come la Candida albicans, e sono fortemente emolitiche.

ESCULENTINE

Dalla secrezione cutanea di anfibi del genere Rana esculenta sono stati isolati peptidi chiamati esculentina-1 e -2 contenenti rispettivamente 46 e 37 residui. Anche nelle esculentine si ha la presenza di un ponte disolfuro che determina la formazione di un anello a 7 termini all’estremità C-terminale.

Le esculentine hanno una spiccata attività contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi, mentre non sono emolitiche. L’esculentina-1, attiva anche contro i funghi, è una delle molecole naturali con il più ampio spettro di attività che si conoscano.

PEPTIDI RICCHI DI ALCUNI AMINOACIDI (Arg, Pro, Trp)

APIDECINE

Sono peptidi di 18 residui isolati dall’emolinfa di Apis mellifera. Hanno un elevato contenuto di prolina (29%) e di arginina (17%). Sembrano essere in grado di legare uno specifico recettore in quanto la forma tutta D dei peptidi è inattiva. Sono attive contro i batteri Gram-negativi.

PR-39

PR-39, isolato dal maiale e successivamente dall’uomo (FALL-39), è un peptide di 39 aminoacidi, di cui 10 Arg e 19 Pro, in grado di bloccare la sintesi del DNA e delle proteine. E’ attivo soprattutto contro i batteri Gram-negativi e si comporta da fattore di crescita per le cellule di mammifero: è stato infatti dimostrato che interviene nei processi di cicatrizzazione delle ferite.

BAC5 E BAC7

Sono stati isolati dai neutrofili bovini, dove vengono immagazzinati nei granuli citoplasmatici. E’ stato suggerito che possano adottare una conformazione anfipatica in ambienti idrofobici. Oltre all’attività antibatterica, inibiscono anche la replicazione del virus Herpes simplex.

PEPTIDI AD a -ELICA

CECROPINA

I primi e tra i più studiati peptidi antimicrobici degli insetti sono state le "cecropine", isolate dall’emolinfa della larva della farfalla Hyalophora Cecropia; questa produce 3 diverse cecropine chiamate di tipo A,B e D. Sono peptidi lineari, basici e composti da 35-37 residui che mostrano il 62-65% di omologia nella sequenza primaria. Ricerche successive hanno identificato in diversi animali numerosi peptidi classificati come cecropine, come ad esempio la cecropina P1, un omologo isolato dall’intestino di maiale.

Per le cecropine degli insetti, molto attive contro i batteri Gram-negativi, è stata ampiamente dimostrata la formazione di canali in grado di dissipare il gradiente elettrochimico. Per la Cecropina P1 invece, poco attiva contro i Gram-negativi, è stato ipotizzato un meccanismo di tipo "detergente" in cui i monomeri di a -elica anfipatica si dispongono sulla superficie della membrana e successivamente ruotano inserendo i residui idrofobici all’interno del doppio strato lipidico, disintegrandolo e distruggendone l’impaccamento.

MELITTINA

La melittina è un peptide isolato dal veleno dell’ape da miele Apis mellifera di 26 aminoacidi con 5-6 cariche positive in grado di legarsi alle membrane assumendo una struttura ad a -elica anfipatica. E’ uno dei peptidi studiati più a fondo e per questo motivo è utilizzata spesso come riferimento per lo studio del meccanismo di nuove molecole. La melittina forma pori multimerici di circa 25-30Å di diametro ed ha un meccanismo d’azione del tipo "tutto o nulla". Contrariamente a quanto accade per le cecropine, l’aumento di lipidi carichi negativamente all’interno delle vescicole inibisce il potere litico della melittina; ciò avviene probabilmente a causa della forte interazione elettrostatica creatasi che impedisce la ridistribuzione del peptide nel doppio strato.

La mellittina è da sempre nota anche come peptide fortemente emolitico. E’ stato ipotizzato un meccanismo di tipo colloide-osmotico in cui il peptide forma inzialmente dei piccoli canali permeabili agli ioni nella membrana dell’eritrocita; successivamente si ha rilascio di emoglobina che può essere misurato valutando la variazione di assorbanza. La lesione aumenta di estensione all’aumento di concentrazione del peptide; la grandezza del poro può essere misurata utilizzando zuccheri e polioli osmoprotettivi di differenti dimensioni.

E’ stato anche visto che la mellittina, come anche altri peptidi emolitici, può danneggiare alcuni tipi di cellule eucariotiche, come i fibroblasti di topo, senza però distruggerle, agendo anzi come co-mitogeno.

MAGAININE

Le magainine sono peptidi di 23 residui secreti dalla pelle della rana africana Xenopus laevis. Sono in grado di proteggere le rane dall’infezione di molti ceppi batterici e mostrano attività anche contro funghi, protozoi ed alcuni tipi di cellule tumorali, ma non sono emolitici.

A basse concentrazioni la magainina si lega parallelamente alla superficie della membrana associandosi alle "teste" polari dei fosfolipidi; aumentando la concentrazione il peptide si dispone perpendicolarmente al doppio strato lipidico formando canali ionici di tipo "toroidale" in cui i monomeri non subiscono aggregazione e non sono in contatto tra loro ma assumono la funzione di rilasciare lo stress della membrana.

DERMASEPTINE

Sono peptidi estratti dalla secrezione di pelle di rane sudafricane della sottofamiglia Phyllomedusinae, da cui sono stati estratti anche peptidi oppioidi come le dermorfine e le deltorfine.

La dermaseptina proviene dalla Phyllomedusa sauvagei ed è costituita da 27 aminoacidi.

L’adenoregulina Ë un peptide di 33 aminoacidi estratto dalla Phyllomedusa bicolor.

Tali peptidi mostrano attività contro alcuni funghi filamentosi.

TEMPORINE

Sono una famiglia di peptidi amidati al C-terminale e contenenti 10-13 aminoacidi isolati dalla secrezione di Rana temporaria. Esse mostrano una certa omologia di sequenza con la melittina, ma sono prive di attività emolitica. Sono particolarmente attive contro i batteri Gram-positivi.

BOMBININE

E’noto da più di 20 anni che la secrezione di Bombina variegata, una rana Europea, possiede attività antimicrobica ed emolitica. Quest’attività fu originariamente attribuita alla bombinina, un peptide di 24 aminoacidi isolata nel 1967. Successivamente sono stati isolati dalla pelle di Bombina orientalis 3 peptidi bombinino-simili, BLP1-3 di 25-27 aminoacidi. Si tratta di peptidi cationici, anfipatici e mostrano una forte omologia di sequenza con la bombinina. I BLP hanno mostrato attività antimicrobica superiore alla magainina 2, ma non hanno attività emolitica significativa.

Nel nostro laboratorio più recentemente sono stati isolati da estratti metanolici della pelle di B.variegata dei peptidi correlati alla bombinina. Questi mostrano attività antibatterica ma non emolitica e sono formati da 27 aminoacidi con la parte C-terminale identica e quella N-terminale variabile. Utilizzando sonde olinucleotidiche derivate da tale regione costante, sono stati isolati molti cloni codificanti per i precursori di questi peptidi bombinino-simili. Dalla sequenza dei precursori, è stata predetta e successivamente confermata l’esistenza di altri peptidi che sono stati chiamati bombinine H, dal momento che sono molto più idrofobici della bombinina e non correlabili strutturalmente ad essa.

In generale la bombinine hanno attività sia contro batteri Gram-positivi che Gram-negativi. Le bombinine H, come vedremo, hanno anche una discreta attività citotossica verso le emazie.

BOMBININE H

Sono peptidi di 17-20 aminoacidi caratterizzati da una sequenza N-terminale Ile-Ile-Gly... e da una sequenza carbossi-terminale Leu-Leu o Leu-Leu-Lys-Lys-Ile, a seconda del processamento subito.

La carica netta +3, determinata con saggi di mobilità elettroforetica, indica che il COOH-terminale è amidato. Molti peptidi bioattivi, neurotrasmettitori e ormoni sia negli invertebrati che nei vertebrati sono caratterizzati dall’amidazione del C-terminale: tale reazione post-traduzionale è operata da un enzima bifunzionale, la PAM (peptidylglicine a -amidating monooxygenase), che è stato isolata anche dalla pelle di rana. La reazione procede attraverso l’ossidazione di un residuo di glicina che segue l’ultimo residuo nella proteina matura: si ha così la formazione del peptide amidato mentre viene rilasciato gliossilato. Il gruppo amidico generalmente è essenziale per l’attività di tali molecole ed è implicato nel mantenimento della loro stabilità.

Sono state caratterizzate diverse varianti di bombinine H che differiscono tra loro per la presenza di isoleucina o leucina in prima posizione, leu o met nell’ottava e, sorprendentemente, isoleucina o D-alloisoleucina in seconda posizione. La presenza di un D-aminoacido è una peculiarità di questa classe di peptidi in quanto fino ad ora non erano mai stati trovati peptidi con attività antimicrobica contenenti tali enantiomeri.

DIFFUSIONE E FUNZIONE DEI D-AMINOACIDI IN NATURA

E’ noto da molto tempo che alcuni antibiotici di origine batterica, come la gramicidina e la tirocidina, contengono enantiomeri di forma D. Il primo peptide di origine animale contenente un D-aminoacido, la dermorfina, fu isolato dalla pelle della Phyllomedusa sauvagei, una rana del Sud America: questo peptide ha una potente attività oppioide e contiene un D-aminoacido in seconda posizione. Successivamente sono state trovate altre dermorfine e deltorfine, peptidi oppioidi con alta selettività per i recettori m e d , nella pelle di differenti specie della sottofamiglia Phyllomedusinae. D-aminoacidi sono stati trovati anche in due neuropeptidi isolati dal cervello di serpente e in peptidi prodotti da altri organismi (crostacei, ragni).

Nella maggior parte dei casi il residuo D si trova in seconda posizione e l’isomero corrispondente contenente l’L-aminoacido risulta privo di attività biologica. Ciononostante entrambi gli isomeri si possono isolare dalla loro rispettiva fonte biologica: nel caso delle bombinine H, infatti, nella secrezione della pelle di B. variegata sono state trovate anche piccole quantità di isomeri contanenti L-alloisoleucina. La presenza di tale forma può essere spiegata presupponendo che la reazione di conversione non sia completa. Infatti, dal momento che l’isoleucina è codificata da un normale codone, si è giunti alla conclusione che avvenga una reazione post-traduzionale in cui viene cambiata la configurazione del carbonio a . Per anni si è cercato l’enzima con attività di racemasi responsabile di tale modifica post-traduzionale: recentemente è stata isolata una frazione enzimatica estratta dalla secrezione di B.variegata in grado di formare Ile-D-allo-Ile-Gly da Ile-Ile-Gly. Questo suggerisce l’ipotesi che l’isomerizzazione sia una modifica tardiva che avverrebbe dopo il taglio del precursore da parte della specifica proteasi: la reazione procederebbe attraverso la deprotonazione e la riprotonazione del C-alfa del secondo residuo a partire dall’N-terminale.

Quale può essere la funzione di questa particolare modifica. Certo è che la formazione post-traduzionale di D-aminoacidi incrementa la diversità di prodotti che possono essere sintetizzati da un solo gene. Inoltre si può avere la formazione di nuovi elementi strutturali, essenziali per l’attività biologica. Infine, i peptidi contenenti D-aminoacidi sono molto più resistenti alle proteasi.

Per quanto riguarda le bombinine H la forma contenente l’enantiomero D è nella maggior parte dei casi quella dotata di maggiore attività biologica ma la ragione rimane ancora oscura. La conversione dalla forma L alla D potrebbe essere in alcuni casi un modo per convertire attraverso un solo passo un precursore inattivo in una forma dotata di forte attività.

STRUTTURA E REGOLAZIONE DEI GENI DELLE BOMBININE

Molti geni correlati all’immunità sono sotto il controllo del fattore di trascrizione nucleare NFk B, appartenente alla famiglia Rel, e dei suoi diversi inibitori chiamati Ik Bs. Nei mammiferi è stato dimostrato che i glucocorticoidi inducono una drammatica sintesi dell’inibitore Ik Ba che è in grado di prevenire la traslocazione di NFk B nel nucleo, in modo da bloccare la trascrizione dei geni il cui promotore contiene siti per tale proteina. Negli insetti questo meccanismo è utilizzato per il controllo sia dello sviluppo che dell’immunità.

Recentemente è stato dimostrato nel nostro laboratorio che il trattamento della pelle di Rana esculenta con glucocorticoidi inibisce completamente la sintesi de novo dei peptidi antimicrobici normalmente presenti nel secreto. Inoltre, utilizzando anticorpi umani contro Ik Ba tramite immunoblotting è stata trovata una grande quantità di questo inibitore nel citoplasma delle cellule epiteliali. Questi risultati suggeriscono che in vivo tale anfibio regola l’espressione dei geni per i peptidi antimicrobici attraverso un meccanismo di tipo NFk B/Ik Ba .

Per quanto riguarda la B. orientalis, è stata determinata nel nostro laboratorio la sequenza di due geni codificanti per i peptidi antimicrobici. Il primo gene sequenziato è costituito da due esoni separati da un largo introne: l’esone 1 codifica per il peptide segnale, mentre l’esone 2 contiene le informazioni genetiche per 2 copie identiche di BLP-3 e per un nuovo peptide HG-1 (gene omologo alle bombinine H). Il secondo gene è organizzato con una struttura simile ma contiene l’informazione per una sola copia di un nuovo BLP e per un altro nuovo peptide omologo alle bombinine H, HG-2. E’ stato visto che la regione del promotore di entrambi contiene siti di riconoscimento per NFk B e per altri fattori nucleari come NF-IL6. Esperimenti in vivo hanno dimostrato che il contatto con i batteri è sufficiente ad indurre un notevole aumento di peptidi nella secrezione, aumento soppresso da un pretrattamento con glucocorticoidi.

INTRODUZIONE ALLA CROMATOGRAFIA

Le tecniche cromatografiche rappresentano un ampio gruppo di procedimenti separativi basati sulla dinamica di distribuzione dei costituenti una miscela contraenti interazioni deboli di diversa energia con una fase stazionaria ed una fase mobile che la attraversa. Tali interazioni determinano la velocità di migrazione di ciascun componente. L'ottimizzazione dei vari parametri cromatografici tende a determinare per ciascun componente una sua specifica velocità di movimento lungo la fase stazionaria fino ad ottenerne la completa separazione fisica dagli altri. Le tecniche cromatografiche sono definite in base ai principi fisico-chimici che sfruttano, classicamente sono suddivise in: adsorbimento, ripartizione, scambio ionico, filtrazione molecolare.

CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO

La cromatografia di adsorbimento utilizza fasi stazionarie sulla cui superficie sono esposti gruppi chimici attivi tendenzialmente come acidi (silice) o come basi (allumina). Per convenzione le fasi stazionarie polari sono dette normali e le separazioni avvengono in fase diretta.

CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE

Questa metodica cromatografica sfrutta la diversa tendenza delle sostanze da separare a ripartirsi tra una fase mobile ed un sottile strato di liquido che riveste un supporto solido, tra loro immiscibili.

La fase stazionaria, generalmente silice, viene ad essere foderata da gruppi quali catene alifatiche o gruppi metilici che le conferiscono caratteristiche spiccatamente apolari. La cromatografia ottenibile in queste condizioni è detta in fase inversa.

CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

Sono tecniche che si basano sull'uso di particolari materiali detti scambiatori di ioni che hanno la capacità di scambiare gli ioni inizialmente ad essi legati con gli ioni presenti in una soluzione. In cromatografia a scambio ionico la fase stazionaria è costituita da un polielettrolita insolubile formato da una matrice cui sono legati covalentemente gruppi ionizzabili, cationici o anionici. Nella fase mobile sono presenti ioni liberi, contro-ioni , che possiedono carica opposta a quella dei gruppi fissi. La competizione tra i contro-ioni ed i gruppi carichi degli analiti verso gli ioni fissi, al variare della forza ionica o del pH, permette la separazione dei vari componenti la miscela.

Le fasi stazionarie scambiatrici di cationi più usate sono costituite da resine con gruppi solfonici o carbossilici, le scambiatrici di anioni contengono gruppi ammonici quaternari.

CROMATOGRAFIA PER FILTRAZIONE MOLECOLARE

Questo metodo cromatografico è basato essenzialmente sulla separazione fisica dei componenti una miscela in relazione alle loro dimensioni molecolari. Il gel costituente la fase stazionaria è un polimero di molecole lineari formanti un reticolo tridimensionale a porosità definita, gli analiti a seconda delle dimensioni penetrano dentro i pori della fase stazionaria. Le molecole di maggiori dimensioni eluiscono più rapidamente dato che a causa dell'ingombro sterico sono impossibilitate a penetrare nel reticolo e scorrono lungo la superficie del gel. Per le molecole più piccole la velocità di eluizione è funzione della loro probabilità di penetrare nei pori.

PURIFICAZIONE IN HPLC DEI PEPTIDI PRESENTI NELLA SECREZIONE DI RANA

La secrezione, liofilizzata, è stata sciolta in 500 m l di una soluzione al 20% di etanolo; un 1/15 del suddetto volume è frazionato in HPLC, utilizzando un cromatografo WATERS, equipaggiato con un Detector 486. E' stata utilizzata una colonna a fase inversa C8, (5 mm), narrow bore (2x250 mm, Vydac).

I peptidi sono stati eluiti con il seguente gradiente:

Le frazioni vengono liofilizzate e una aliquota viene utilizzata per l’analisi delle capacita’ antibiotiche e citolitiche.

CRESCITA MICROBICA

Anche i microrganismi come tutti gli esseri viventi, per poter compiere le loro funzioni vitali e riprodursi devono trovare nell’ambiente in cui vivono tutte le sostanze necessarie per il rifornimento di energia e per i processi biosintetici che hanno luogo nelle cellule.

I principali costituenti dei terreni colturali sono:

l’acqua in cui sono disciolte tutte le sostanze nutritive ed in cui avvengono tutte le reazioni metaboliche;

il carbonio la cui fonte principale è rappresentata dagli zuccheri per i microrganismi eterotrofi e dalla CO₂ per gli autotrofi;

l’azoto che può essere utilizzato da molte specie batteriche sotto forma di sali di ammonio e di nitrati o come azoto organico cioè aminoacidi, peptoni (ottenibili dalle proteine per idrolisi acida o enzimatica) o proteine;

il fosforo, principale costituente degli acidi nucleici e solitamente aggiunto nel terreno colturale sotto forma di fosfati in modo tale da creare un sistema tampone che minimizzi durante tutta la crescita le variazioni di pH dovute sia alla utilizzazione di sostanze nutritive che all’accumularsi dei prodotti del metabolismo;

fattori di crescita ovvero tutti quei metaboliti che la cellula non può sintetizzare perché priva della catena biosintetica. In genere tali deficienze nutrizionali sono frequenti per le vitamine del gruppo B, per alcuni aminoacidi, basi puriniche e pirimidiniche. In molti casi la presenza di tali fattori non è indispensabile, ma ha comunque un effetto stimolante la crescita diminuendo le reazioni di sintesi della cellula; una fonte generica di tali fattori è rappresentata dall’estratto di lievito.

l’ossigeno molecolare per i microrganismi aerobi, la cui fonte è l’aria che viene fatta circolare nel recipiente contenente la coltura microbica sottoponendolo ad agitazione.

Nei terreni liquidi, la crescita microbica può essere seguita osservando l’aumento della torbidità; nei terreni solidi, ovvero in piastra, invece, le singole cellule si riproducono nel punto in cui vengono a trovarsi dando luogo alla formazione di colonie, cioè gruppi di cellule costituiti da una popolazione omogenea perché derivante da una singola cellula.

Per solidificare i terreni si utilizza un polimero del galattosio detto agar che non essendo utilizzato come fonte di carbonio non influenza la crescita dei microrganismi.

DETERMINAZIONE DEL NUMERO DI CELLULE DURANTE LA CRESCITA IN TERRENO LIQUIDO

Il metodo di gran lunga più utilizzato è quello basato sulla torbidità della coltura che può essere determinata rapidamente allo spettrofotometro. Tale torbidità è causata dalla diffusione della luce dovuta all’alto indice di rifrazione dei batteri. Si usano in genere lunghezze d’onda comprese tra 500 e 600 nm e la torbidità varia linearmente col numero di cellule batteriche.

E’ possibile pertanto ricavare indicazioni numericamente abbastanza precise eseguendo curve di taratura che mettono in relazione la torbidità misurata con il numero di cellule batteriche che è possibile conoscere eseguendo successivi prelievi della coltura in crescita per la semina in piastra.

STUDIO DELLA CRESCITA MICROBICA

Mediante il metodo della conta in piastra di cellule vive è possibile ottenere una curva di crescita che indica l’evoluzione numerica di una popolazione microbica dal momento della sua semina a quello della morte di tutte le cellule. Ciò permette di stabilire il tempo che intercorre tra una divisione e l’altra e l’influenza che possono avere la composizione del terreno e fattori fisici ambientali quali il pH, la temperatura...importanti quando si vogliano rendere ottimali le condizioni di crescita.

Poiché le forme microbiche si riproducono asessualmente per divisione binaria, la crescita è di tipo esponenziale, ovvero il numero di cellule presenti dopo un certo tempo sarà uguale a 2n dove n rappresenta il numero di divisioni che si sono avute in un certo intervallo di tempo. Se si riporta in un grafico il numero delle cellule determinate in piastra in funzione del tempo partendo dal momento in cui si effettua la semina, avremo un andamento esponenziale; riportando i sull’ascissa il tempo e sull’ordinata il logaritmo del numero delle cellule si ha pertanto una retta.

Si possono riconoscere 4 fasi in cui la 1 e la 3 essendo parallele all’ascissa indicano momenti in cui le cellule non si riproducono e sono chiamate rispettivamente fase lag e fase stazionaria.

Tra esse vi è la fase esponenziale di crescita (fase2). La 4 fase (fase di mortalità) indica che da un certo momento in poi le cellule diminuiscono numericamente con andamento esponenziale.

Fase di latenza: in tale fase non si ha crescita microbica né sintesi di prodotti, ma solo consumo energetico e la durata di tale periodo è varia e dipende:

1) dalla composizione del terreno colturale da cui le cellule sono prelevate e quello in cui vengono inoculate: se ad esempio varia la fonte di C o N la durata di tale fase corrisponderà al tempo impiegato per la sintesi degli enzimi necessari a metabolizzare i nuovi composti;

2) dalla temperatura del nuovo terreno colturale;

3) dall’età della coltura seminata: se le cellule della semina sono vecchie le loro attività metaboliche riprenderanno più lentamente;

4) dal numero di cellule seminate: maggiore sarà il numero di cellule inoculate, minore la durata della fase lag.

Fase esponenziale: in tale fase le cellule si riproducono con un tempo di generazione costante determinato sia dalle caratteristiche genetiche del microrganismo che da fattori ambientali quali il pH, la temperatura e la quantità di sostanze nutritive (sarà elevato in terreni poveri essendo richiesto un maggior numero di reazioni biosintetiche). Per E.coli in condizioni ottimali il tempo di generazione è di circa 20 min.

Fase stazionaria: in tale fase le cellule non sono più in grado di riprodursi per l’esaurimento anche di uno solo dei componenti del terreno colturale e per l’accumulo di prodotti del metabolismo che alterando il pH rendono impossibili le normali reazioni biosintetiche.

Fase di mortalità: aumenta il numero delle cellule che perdono la capacità di riprodursi e la morte dei singoli individui procede con andamento esponenziale.

L’attività antimicrobica dei peptidi è stata analizzata con il metodo del "Saggio della zona di inibizione". Tale metodologia si è rivelata essere molto più efficiente nell’analisi dei peptidi antimicrobici rispetto al metodo della minima concentrazione inibente (MIC), largamente utilizzato per gli antibiotici classici, poichè il diametro della zona di inibizione è proporzionale alla concentrazione del peptide anche in presenza di elevate concentrazioni. Inoltre, da misure dell’alone d’inibizione a concentrazioni diverse del peptide è possibile calcolare la concentrazione letale (LC) in termini di molarità. Va evidenziato che per il metodo MIC è spesso necessario utilizzare quantità molto piccole di campione, il che aumenta molto il margine di errore.

Inoltre va considerato che i peptidi antimicrobici agiscono secondo una reazione ad andamento stechiometrico; il diametro della zona di inibizione risulta proporzionale al logaritmo della concentrazione in un intervallo che va da 0,05 a 10 m M, il che permette di ottenere curve di taratura utili per risalire alla concentrazione del peptide stesso.

SAGGIO DELL’ALONE DI INIBIZIONE

L’attività antimicrobica dei peptidi in esame è normalmente analizzata mediante il saggio della zona di inibizione su piastre di agarosio infettate con vari ceppi batterici: Bacillus megaterium BMII, Staphylococcus aureus Cowan I (Gram-positivi) o E. coli D21, E.coli D22, Yersinia pseudotubercolosis YPIII, Pseudomonas aeruginosa ATCC15692, Aeromonas hydrophila Bo-3N e Enterobacter agglomerans Bo-1S (Gram-negativi). I batteri vengono fatti crescere in 10 ml di terreno LB fino a una densità ottica di 1 a 590 nm. Le cellule vengono poi diluite 1:6000 (per i ceppi Gram-negativi) o 1:1200 (per i ceppi Gram-positivi) prima di essere piastrate. Su ogni piastra (Falcon, diametro 11 cm) vengono versati 6 ml di agarosio (Sigma, A6013) all'1% miscelato con terreno di coltura LB contenente circa 4,8x10⁵ unità di batteri capaci di formare colonie (cfu).

L’attività antimicotica viene saggiata utilizzando un ceppo di Candida albicans ATCC 10261. Le cellule sono poi poste a crescere in 10 ml di terreno WB sino ad una densità ottica di 0,6 a 590 nm, sono diluite di 300 volte in 6 ml di WB/ 1% agarosio e sono infine piastrate.

Un numero definito di pozzetti nel letto di agarosio, ben asciutto, viene prodotto utilizzando un apposito perforatore, una pipetta Pasteur collegata ad una pompa ad acqua. Occorre fare attenzione a non rovinare il margine del pozzetto, per evitare la formazione di zone di inibizione asimmetriche che renderebbero difficoltosa la misura dell'alone di inibizione. Si depongono 3 m l della soluzione in esame in ciascun pozzetto. Dopo 30 min le piastre vengono poste in incubatore a 30°C per 12 ore. La concentrazione letale viene determinata con un opportuno programma per microelaboratore misurando il diametro degli aloni di inibizione ottenuti con diluizioni in serie della sostanza esaminata.

E’ necessario fare attenzione ad alcuni parametri, come la precisione del prelievo, la qualità delle piastre (che devono essere perfettamente piatte), l’utilizzo di una superficie in piano, ambiente sterile, ecc.

SAGGIO DI INIBIZIONE DELLA CRESCITA BATTERICA

Preparazione dei batteri:

Inoculare una singola colonia in 10 ml di LB, crescere a 37°C sino a densità ottica 1 a 590 nm. Diluire le cellule a 10⁶ cell/ml in PBS (in NaCl 0.45% per Bo-3N).

-Porre il peptide in una provetta (x m l di volume in etanolo al 20% a seconda della concentrazione finale determinata) insieme ad una aliquota di tampone PBS (o NaCl 0.45%) fino a raggiungere il volume finale di 90 m l.

-Aggiungere 10 m l della soluzione di cellule ed incubare a 30°C.

-Prelevare a successivi intervalli di tempo 10 m l della miscela, diluirli in 3 ml di agar-morbido (mantenuto liquido a 45°C), mescolare accuratamente e trasferirli su piastra Petri LB-agar (precedentemente riscaldata a 37°C). Lasciare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti e poi versare 3 ml di agar-morbido sterile. Per controllo si appronta una provetta priva di peptide da cui si prelevano aliquote al tempo zero ed alla fine dell’esperimento.

-Incubare le piastre per 12-15 ore a 30°C.

-Contare le colonie.

SAGGIO DI EMOLISI

Il potere citolitico dei peptidi può essere convenientemente analizzato in solido con un procedimento analogo a quello del saggio di inibizione, mediante determinazione dell’alone di lisi su piastra di agarosio:

-5 ml di sangue fresco

-20 m l di EDTA 200 mM (per inibire la coagulazione chelando il calcio)

-Centrifugare per 10 min a 3000 rpm.

-Rimuovere il sopranatante.

-Lavare per due volte con 10 ml di NaCl 0.9%.

-Centrifugare per 10 min a 3000 rpm.

-Diluire in modo tale che 600 m l della soluzione diluiti con 5,4 ml di acqua diano dopo lisi un valore di densità ottica pari a 0,5 a 500 nm.

-dissolvere 1 g di agarosio Sigma A-3069 in 100 ml di NaCl 0,9% e mantenere a 50°C;

-mescolare 5,4 ml di agarosio con 600 m l della soluzione di emazie precedentemente diluita;

-versare in capsula di Petri e lasciare solidificare per 30 min;

-deporre il peptide nei pozzetti ed attendere 30 min;

-incubare per 12 ore a 37°C.

Avvisi per gli Studenti

Attività elettive