LA DISSEZIONE

Il termine Anatomia significa incidere, tagliare, sezionare, dissecare o dissezionare. Le metodiche dissettorie nell'antica Cina imperiale, qualche secolo prima di Cristo, erano applicate esclusivamente al vivente, mentre erano proibite sul cadavere.

I! metodo della dissezione oggi non può essere applicato naturalmente all'organismo vivente, ma solo al cadavere.

Fino a qualche tempo fa, le salme di individui morti in Ospedale non richieste dai familiari per il trasporto funebre, spettavano di diritto agli Istituti Anatomici. Oggi, quasi tutti parenti dei defunti ed in mancanza di questi gli Istituti di previdenza, dato il notevole progresso sociale e civile, assicurano il trasporto funebre anche alle persone povere ed indigenti, e pertanto agli Istituti di Anatomia non arrivano più salme, e non è più possibile fare dissezione.

In alcuni casi si ricorre alle autopsie eseguite negli Istituti di Anatomia Patologica a sco­po di riscontro diagnostico, oppure si ricorre ad esercizi di Anatomia Chirurgica per reperire arterie, vene e nervi. Pur non negando l'utilità di tali tecniche, esse non danno un'idea precisa dell'Anatomia sistematica e topografica, in quanto non permettono la visione diretta didattica di una regione anatomica osservata in tutte le sue componenti, in tutti i suoi strati ed in tutti i suoi dettagli descrittivi.

L'Anatomia deve essere assimilata non solo per mezzo di studio teorico, e di nozioni mnemoniche, ma soprattutto per mezzo di immagini, e, mancando la visione diretta delle "regioni anatomiche mediante dissezione, più che mai si deve ricorrere ai sussidi audiovisivi moderni, che sono:

- visione di dissezioni registrate su nastro;

- interpretazione di preparati istologici al microscopio;

- osservazione di radiografie delle diverse regioni anatomiche e dei differenti distretti circolatori;

- visione di fotografie di preparati anatomici macroscopici e microscopici.

Ogni immagine anatomica dev'essere oggetto di una ripetuta attenta osservazione, tale da evidenziare tutti i dettagli morfologici e descrittivi. Solo così è possibile ovviare alla mancanza della dissezione anatomica diretta.

Riteniamo superfluo esporre uno schema delle tecniche dissettorie comuni. È però ne­cessario che lo studente si renda conto dei principi generali che sono serviti per preparare il materiale riprodotto nei libri di Anatomia Umana Normale. Allo stesso tipo di prepara­zione deve essere sottoposto il materiale anatomico che serve per le lezioni pratiche di Anatomia Macroscopica.

a)    Fissazione del cadavere

La salma viene iniettata, a bassa pressione, e lentamente in modo da introdurre nel letto vascolare, in 24 ore circa, dai 15 ai 18 litri di un fissativo così composto:

Alcool……………………3lt

Glicerina .......……………1lt

Formalina ......……………1lt

Acido fenico .…………….200gr

Acetato di Potassio……….800gr

Nitrato di Potassio………..200gr

Cloruro di Sodio .………...800gr

Acqua .........………………10lt

La perfusione è bene che venga fatta attraverso l'arteria femorale. A perfusione avvenu­ta la salma viene immersa in una vasca contenente la stessa miscela e qui rimane per alme­no 20 giorni.

Dopo questo periodo la salma viene deposta in un sacco di plastica a tenuta, e conserva­ta m una cella frigorifera a 2-4°C. La conservazione dura indefinitamente.

b) Tecnica dissettoria e di congelamento associate per la preparazione dei visceri 'in situ'.

Con le tecniche dissettorie comuni la parete del tronco anche se fissata chimicamente perde, una volta aperte le cavità, la sua forma; e i visceri, soprattutto i polmoni ed il tubo digerente, dopo l'apertura della cavità toracica ed addominale si riducono di vo­lume, alterando così i rapporti originali. Per ovviare a questo inconveniente si esegue la dissezione su materiale fissato e congelato seguendo questo procedimento-

1) Congelare completamente la salma mediante esposizione prolungata ad una temperatura di -20° C;

2) Condurre una sezione tangente alla parete del tronco;

3) Lasciare scongelare le parti superficiali e iniziare la dissezione di queste;

4) Dissecato il piano superficiale si asportano le parti scongelate fino a raggiungere il piano più profondo ancora congelato cercando di mantenere congelato il blocco nel suo insieme durante la preparazione.

OSSER VAZIONE DEGLI ORGANI AL TA VOLO OPERA TORIO

Durante gli interventi chirurgici eseguiti a scopo terapeutico sul vivente, è possibile l'os­servazione diretta degli organi al tavolo operatorio.

Da tale osservazione il Chirurgo ricava la sua esperienza diretta sui reciproci rapporti degli organi, sulla loro irrorazione e sulla loro funzione.

Tale esperienza integra ed arricchisce quella del perito settore e dell'anatomico che os­servano gli organi solo sul cadavere.

L'osservazione degli organi interni al tavolo operatorio permette di acquisire nozioni fondamentali di Anatomia Clinica, derivate direttamente da studi eseguiti sul vivente.

Le differenze maggiori che si riscontrano riguardano i rapporti reciproci degli organi diversi nel vivente rispetto ai rapporti che si osservano sul cadavere, il colorito diverso do­vuto alla irrorazione e soprattutto la diversa funzionalità e la motilità

 

Capitolo II

IL PRELIEVO DI FRAMMENTI DI ORGANO

La prima fase nella esecuzione di un preparato istologico da esaminare al microscopio è il prelievo.

È superfluo dire che l'esito finale di un preparato di anatomia microscopica dipende, in gran parte, dalla correttezza con la quale si esegue il prelievo. Occorre operare un corretto prelievo per eseguire un preparato valido; molto spesso, purtroppo, i preparati istologici sono non validi dal punto di vista didattico perché il frammento non corrisponde agli sco­pi prefissi, oppure si è prelevato un frammento poco significativo. Se, per esempio si vuole osservare l'endometrio, bisogna asportare un frammento a quel livello, e non prelevare so­lamente miometrio o parametrio.

Passiamo ora ad esaminare le varie operazioni necessarie per effettuare un corretto pre­lievo sia sull'animale da esperimento che sull'uomo.

 

PRELIEVO SULL'ANIMALE DA ESPERIMENTO

In base alla mole possiamo distinguere gli animali da laboratorio in animali di piccola taglia (topi, ratti, cavie etc.) e di media taglia (conigli, gatti etc.). Per gli animali di grande taglia (maiali, cani, scimmie etc.) valgono le stesse considerazioni che faremo a proposito dell'uomo.

Prima di procedere alla dissezione è necessario sacrificare l'animale, seguendo metodi­che ben precise.

Dopo aver tolto l'animale dalla gabbia, lo si pone in un apposito recipiente a tenuta, do­ve è stato introdotto in precedenza un batuffolo di ovatta imbevuta di etere etilico. È op­portuno interporre fra l'animale ed il batuffolo impregnato d'etere un disco di cartone, in modo da evitare che l'etere possa bruciare la cute dell'animale.

Questo sistema di sacrificio, completamente incruento, è detto anestesia terminale, per­ché l'animale passa, per così dire, direttamente dal sonno alla morte senza inutili sofferen­ze peraltro perseguibili a norma di legge. Dopo essersi ben assicurati del decesso, si proce­de alla dissezione.

È indispensabile in questo caso una buona illuminazione del campo operatorio, facendo attenzione che non vi siano ombre che disturbano l'operatore.

Per prima cosa occorre fissare l'animale su una tavola di sughero mediante spilli, che andranno infissi alle estremità degli arti. Con una pinza si solleva la cute dell'addome, e con una forbice si inizia a tagliare procedendo caudo-cranialmente. In corrispondenza del­la prima costa e dell'osso iliaco, si esegue con la forbice un taglio laterale, in modo da po­ter aprire la cute a libro e lasciare così scoperti i piani muscolari sottostanti, resecando con il bisturi eventuali residui cutanei di fissità.

A questo punto si evidenziano le anse intestinali, che si ribaltano verso l'alto.Il punto di repere dell'intestino è l'ansa duodeno-digiunale del Treitz, ed è qui che occorre tagliare con la forbice. Una volta svolto l'intestino, si sceglie l'organo da prelevare.

Per stomaco e duodeno vale lo stesso discorso, ma è opportuno asportarli dopo aver asportato il fegato.

Nel topo e nel ratto il fegato si presenta plurilobato, e deborda dall'arcata costale per cui nasconde lo stomaco. Per asportarlo si pinza il peduncolo a livello dell'ilo e si fa tra­zione, provvedendo contemporaneamente a recidere i mezzi di fissità epatici con la forbice ed il bisturi. Per la milza si procede come per il fegato, tenendo presente che i legamenti splenici sono molto più deboli di quelli epatici.

Dopo aver asciugato con una garza il cavo addominale, si isolano i reni, e si asportano sempre tenendo il peduncolo in trazione con la pinza e recidendo con la forbice.

Questo sistema di estrazione, che potremmo definire a grappolo, è comune, nell'anima­le, per tutti gli organi che presentano un peduncolo. Nel caso occorresse prelevare la vescica, è consigliabile farlo senza prima aprirla e cioè quando è piena, perché il collabimento delle pareti può rendere arduo il prelievo.

Il prelievo dei testicoli non presenta alcuna difficoltà, in quanto in questi animali i testi­coli sono molto sviluppati rispetto alla mole totale dell'organismo.

L'utero ha la particolarità di essere biforcuto, e la sua forma a Y lo rende immediata­mente riconoscibile. Si taglia con la forbice a livello vaginale, si fa trazione con la pinza si tagliano i legamenti con la forbice, e si asportano in toto utero ed annessi (ovaie, tube, fimbrie).

L'asportazione dell'aorta addominale avviene dopo l'isolamento del vaso; dapprima es­sa viene liberata dalle strutture connettivali adiacenti, dopodiché le si inserisce una pinza posteriormente, in modo da tenere sollevato il tratto prescelto. Infine si taglia la porzione da esaminare.

L'esame della cavità toracica inizia con la resezione del piastrone sterno-costale, in mo­do da mettere allo scoperto i polmoni ed il mediastino. Un buon metodo è quello di esegui­re un taglio sulla trachea ed asportare in blocco tutto il contenuto, riservandosi successiva­mente di suddividere i vari organi.

L'apertura della scatola cranica, per quanto riguarda il prelievo dell'encefalo, deve esse­re fatta senza staccare la testa dal tronco, perché si evitano in questo modo pericolosi tagli che potrebbero interferire con il risultato dell'operazione. Con una forbice si incide la cute e la si asporta; indi si taglia il cranio seguendo la sutura sagittale. Con la pinza si possono troncare ed asportare le ossa parietali e mettere in evidenza l'encefalo, per asportarlo par­tendo dal tronco cerebrale e facendo attenzione a non ledere le strutture della base.

Il midollo spinale si isola dopo aver asportato il rachide con una pinza speciale, tirando­lo fuori dallo speco vertebrale.

Dopo aver prelevato gli organi si deve provvedere al loro successivo sezionamento, che sarà eseguito a seconda degli scopi da raggiungere.

L'encefalo deve essere ulteriormente tagliato secondo tagli standard, che seguono gros­so modo le indicazioni di Virchow; si parte da punti di repere fissi e si eseguono tagli fron­tali (di Flechsig, di Dejerine etc.). I punti di prelievo sono a discrezione dell'operatore, ed è opportuno che abbiano le stesse caratteristiche, in modo da ottenere sempre gli stessi standard morfologici.

L'intestino deve essere tagliato secondo un piano trasversale, in modo da poter osserva­re al microscopio tutte le tuniche in successione.

Questo discorso vale per ogni organo cavo. Allo scopo di evitare il collabimento delle pareti è necessario riempire il lume con una resina, in modo da lasciarlo beante. Nel caso dell'aorta, tale operazione può essere fatta anche in situ mediante una siringa, ma l'espe­rienza ci ha insegnato che questo sistema può essere evitato, in quanto la struttura musco­lare di questa arteria rende il lume beante e le tuniche facilmente riconoscibili.

Quando invece si ha la necessità di esaminare una singola tonaca del vaso, si esegue la tecnica dello stretch. Questa consiste nell'asportare con la pinza lo strato da esaminare,  per schiacciarlo fra due vetrini portaoggetti fino a renderlo più sottile possibile, e si proce­de quindi per le reazioni previste. Queste metodica è molto usata per eseguire reazioni enzimatiche (AChE secondo la tecnica di El-Badawi) e per studiare l'innervazione adrenergica (tecnica di Falck-Hillarp).

Un organo parenchimatoso che presenta la stessa struttura ad ogni tipo di sezione, deve essere tagliato in cubetti tetragonali. Il frgato, grosso modo, deve essere sezionato a forma di parallelepipedo, mentre la milza, che  nell'animale da esperimento ha sezione triangolare, può essere suddivisa in tre regioni:  terzo superiore, intermedio, inferiore.

Il pancreas può essere incluso in toto, viste le ridotte proporzioni che questo organo ha nell'animale.

I reni, che nell'uomo debbono essere tagliati secondo canoni ben precisi, nell'animale possono essere sezionati con due metodi diversi: o si esegue una sezione longitudinale, parallela cioè all'asse maggiore, o si effettuano tagli trasversali, suddividendoli in terzo superiore, intermedio (comprendente il bacinetto) ed inferiore.

I polmoni è bene che vengano conservati separatamente, e che i tagli al microtomo partano dall'ilo, in modo da avere, con sezioni seriale, la configurazione tridimensionale delle diramazioni bronchiali e vascolari. Il cuore può essere tagliato longitudinalmente e trasversalmente, a seconda delle aree da esaminare (atri, ventricoli, setti interatriali, atrio-ventricolari e interventricolari).

L'utero comporta le stesse metodiche degli organi cavi, mentre i testicoli possono essere tagliati come il rene.

Per quanto riguarda lo studio sugli embrioni di animali, le uniche differenze consistono nel prelevare con lo stereomicroscopio operatorio i singoli organi che per le loro minori di­mensioni non richiedono ulteriore sezionamenti.

 PRELIEVO SULL 'UOMO

I prelievi umani possono essere suddivisi in autoptici se eseguiti sul cadavere e bioptici se eseguiti sul vivente (nel corso di interventi operatori o di indagini endoscopiche etc.). Le biopsie sono molto usate nella diagnostica, in quanto rivelano la struttura microscopica delle lesioni, ed inoltre, durante gli interventi operatori, danno ai chirurghi l'opportunità di conoscere il grado della lesione e di comportarsi di conseguenza. Il fine del prelievo autoptico invece serve a stabilire l'esatta causa di morte.

PRELIEVO AUTOPTICO

Non staremo qui ad elencare il metodo per eseguire correttamente una dissenzione autoptica sul cadavere, rimandando al riguardo a testi più pertinenti (Businco, Saphir, Mottura), ma ci limiteremo a descrivere le metodiche per eseguire un corretto prelievo degli or­gani.

Il prelievo di un organo deve essere fatto su una superficie non troppo dura né troppo elastica, in modo da non creare artefatti da compressione; si usa in genere una tavoletta di sughero.

Gli strumenti (forbici, bisturi, coltello) debbono essere ben affilati, ed è buona norma lavarli accuratamente assieme alla tavoletta dopo ogni prelievo. Questo serve ad eliminare inquinamenti da parte di minuti frustoli di organi diversi, che potrebbero insediarsi fra le pieghe delle pinze o sulle lame di coltelli e forbici. Nella tecnica istologica è preferibile usa­re sempre il coltello ed il bisturi, e limitare al massimo l'uso delle forbici.

Una volta prelevato, il frammento va immerso in una soluzione isotonica allo scopo di eliminare il più possibile il contenuto ematico, mucoso etc. Si adoperano soluzioni tampo­ne (PB, PBS etc.) o soluzione fisiologica. Il pezzo va tenuto in lavaggio per circa 10', quin­di va trasferito il più presto possibile in fissativo, o a -20°C in congelatore. Questa metodi­ca vale naturalmente anche per il prelievo effettuato dagli animali da esperimento. Esami­niamo ora singolarmente le metodiche di prelievo dei vari organi.

Encefalo - Va tagliato secondo i piani già descritti in precedenza. Per esempio, se si vuo­le esaminare la struttura della corteccia piramidale, si esegue una sezione di Charcot a li­vello della scissura di Rolando, e da qui si asportano i frammenti.

Per sezionare l'encefalo ci si avvale di un coltello speciale, denominato cefalotomo o encefalotomo o bitagliente che avendo lo spessore della lama uguale al filo della stessa, ha la proprietà di non lacerare la sostanza cerebrale. Per maggior sicurezza, però, è consigliabi­le bagnare con acqua il bitagliente, in modo da eliminare ogni possibilità di adesione della materia cerebrale sulla lama. L'encefalo va raccolto con la mano sinistra e poggiato su una pezza, ed il taglio della sostanza cerebrale non deve essere a pressione ma a scorrere. In se­guito il frammento deve essere ribattuto e preso con il bitagliente.

Midollo spinale - Le sezioni vanno fatte a livello della regione da esaminare, e in genere si eseguono tagli trasversali con il cefalotomo. La sezione può essere fissata ed inclusa in toto, e tagliata intera al microtomo.

Organi cavi - Vanno sezionati trasversalmente con le forbici, in modo da ottenere un frammento della lunghezza massima di 1 cm. Nel caso si tratti di pezzi con diametro non eccessivo (generalmente vasi di piccolo e medio calibro, ureteri, condotti biliari etc.), si può procedere verso le fasi successive senza ulteriori sezioni, ma se il preparato ha un dia­metro abbastanza rilevante (intestino, aorta, v. cava etc.), si può procedere incidendo con le forbici la parete a tutto spessore, fino ad ottenere un frammento quadrangolare che comprenda tutte le tuniche. In genere l'intestino e lo stomaco si tagliano con le forbici, mentre i vasi arteriosi si tagliano con il bitagliente.

Stomaco - Pur essendo un organo cavo, la sua conformazione morfologica a sacco non permette di eseguire prelievi di tutta la circonferenza. A seconda degli scopi si asporteran­no quindi frammenti a livello del fondo gastrico, della grande e piccola curvatura, del cor­po, dell'antro e del piloro. La forma sarà quandrangolare ed a tutto spessore (compren­dente cioè tutte le tuniche).

Fegato - Dopo aver deposto l'organo sul piano, si esegue con il bitagliente un taglio lon­gitudinale sull'asse maggiore. Tale taglio non deve dividerlo in due, e nell'esecuzione biso­gna procedere a scorrere, e bisogna iniziare dall'ilo del viscere. Si preleva poi il frammento desiderato. Dato che il fegato è un organo parenchimatoso a struttura pressoché costante in ogni suo punto, i prelievi saranno rettangolari.

Milza - Ha le stesse caratteristiche del fegato, e, per distinguere i frammenti splenici da quelli epatici, si usa tagliare questi in forma grosso modo cubica. Inoltre occorre fare pre­lievi che comprendano sempre la capsula.

Polmoni - Essendo a contenuto gassoso, questi organi presentano non poche difficoltà alla indagine microscopica, in quanto sono possibili notevoli artefatti dovuti ad errate ma­nipolazioni tecniche. Per prima cosa si depongono i polmoni sul piano, o, se si preferisce, su una tavola sufficientemente ampia. Si orientano quindi con la base rivolta verso il setto­re e si tagliano dall'ilo seguendo l'asse maggiore. A questo punto si esamina l'interno dell'organo, e si preleva la regione prescelta. È sempre molto utile asportare contempora­neamente un bronchiolo con una regione di parenchima, in modo da osservare sia l'epite­lio respiratorio che l'endotelio alveolare. A questo proposito è opportuno eseguire un prelievo triangolare (come per il rene) con apice verso il bronco.

Cuore - La dissezione del cuore segue delle metodiche ben precise, per le quali si riman­da a testi specialistici. Lo studio delle cavità cardiache e dei vasi, oltre che con le tecniche settorie, può essere anche eseguito radiologicamente, e tramite iniezione di mezzo di con­trasto si possono anche evidenziare i capillari linfatici e vascolari. Istologicamente ci sì li­mita all'esame della struttura del miocardio, pericardio ed endocardio, dei lembi valvolari e dei muscoli papillari, nonché, con tecniche istochimiche, si studia la struttura del sistema di conduzione. Il prelievo delle diverse regioni del cuore prevede una buona conoscenza dell'anatomia dell'organo, ed è in funzione del tipo di esame da eseguire.

Formazioni nodulari - È consigliabile prelevare gli organi interi e fissarli, ed in seguito sezionarli. Si tratta di linfonodi, di ghiandole endocrine e di strutture nodulari in genere (tonsille, ovaie etc.). Si isola la formazione dai tessuti circostanti, e si seziona seguendo l'asse maggiore, possibilmente a livello dell'ilo.

Muscoli - II prelievo di tessuto muscolare va fatto a livello del corpo, o, a seconda dei fi­ni, in regione iuxtatendinea. Il preparato avrà sezione quadrangolare e, all'atto dell'inclu­sione, potrà essere orientato sia secondo l'asse trasversale che longitudinale.

Rene - II prelievo del rene ha forma triangolare con apice rivolto verso la pelvi. Con il bitagliente si seziona l'organo lungo l'asse maggiore, facendo compiere alla lama una ro­tazione di circa 180°, in modo da mantenerla sempre tangente all'organo stesso. Il rene sa­rà impugnato strettamente in corrispondenza dell'ilo, poiché la capsula può condurre fuori direzione il taglio. Quindi si prende la metà prescelta e si preleva con il bisturi il fram­mento, badando a comprendere in esso sia le piramidi che le colonne di Bertin. Si consiglia perciò di tagliare a livello di due emipiramidi contigue, in modo da avere le medesime ai la­ti e la colonna al centro.

Utero - Dopo averlo asportato, si esegue una sezione sagittale a tutto spessore, e si prele­vano rettangoli di tessuto facendo attenzione a comprendervi tutte le tuniche. Le modalità non cambiano sia che si tratti del fondo o del corpo o della cervice.

Cute - È bene ricordare che il rettangolo cutaneo da prelevare deve contenere sia l'epi­dermide che il derma, ed è buona norma quindi approfondire il taglio fino al tessuto adi­poso sottocutaneo. Ciò è molto importante sia in Anatomia Normale, in quanto, per esempio, un frammento solo epidermico escluderebbe le ghiandole sudoripare che sono intradermiche, sia in Anatomia Patologica, perché un errato prelievo potrebbe non dare esatte indicazioni circa la precisa estensione di una eventuale lesione. Si rammenti inoltre che la cute è un organo che non si presta a lunghe conservazioni in fissativo, per cui il frammento deve essere colorato al più presto possibile.

PRELIEVO BIOPTICO

Questo tipo di prelievo può essere suddiviso in: operatorio ed extraoperatorio.

Operatorio - presenta  notevoli difficoltà di esecuzione rispetto ai prelievi autoptici.

Extraoperatorio - rientra nelle metodiche endoscopiche, broncoscopiche oppure nelle agobiopsie.

Questi prelievi, consistono di solito in piccoli frustoli di tessuto che vanno fissati ed inclusi senza ulteriori operazioni di taglio.

 

I PRINCIPALI FENOMENI POST-MORTALI

Lo studio dei fenomeni post-mortali prende il nome di tanatologia (dal greso tanatos = morte e logos = scienza), e, oltre ai fenomeni biologici in senso stretto, studia anche le cause del decesso.

I fenomeni post-mortali si dividono in negativi e positivi, ed i primi possono essere an­cora distinti in immediati e consecutivi. I segni immediati della morte sono: perdita della coscienza, della sensibilità e della motilità; quelli consecutivi sono: perdita dell' eccitabilità neuro-muscolare, ipostasi, raffreddamento, rigidità cadaverica, disseccamento delle parti umide ed evaporazione.

C'è da notare che, mentre i segni negativi sono dovuti alla mancanza di vita, quelli posi­tivi dipendono dalla sopravvenuta morte.

In questa sede non ci sembra opportuno soffermarci sui fenomeni negativi, m quanto essi sono di pertinenza medico-legale (fenomeni immediati e consecutivi) e dell'Anatomia Patologica (prevalentemente i fenomeni consecutivi).

Parleremo quindi solamente dei fenomeni (o segni) positivi, soffermandoci però solo su quelli iniziali, senza inoltrarci nella descrizione dei segni positivi avanzati (varie fasi della

putrefazione)

I fenomeni positivi sono influenzati da una serie di fattori, che possiamo dividere in estrinseci ed intrinseci.

a)   fattori estrinseci:

1) Temperatura - al di sotto dei 10°C ed al di sopra dei 40°C i fenomeni litici diminui­scono.

2) Umidità -favorisce la putrefazione, mentre una buona ventilazione la ostacola.

3) pH -L'acidità favorisce lo sviluppo di germi anaerobi, che accelerano processi de­generativi.

b)   fattori intrinseci: .

I fenomeni litici sono meno rapidi nei feti e nei nati morti, in quanto essi hanno il ca­nale alimentare ancora sterile. Un organo dissanguato resiste di più alla putrefazione perchè la flora batterica non trova subito il terreno di coltura idoneo.

Gli antibiotici ed alcuni veleni (acido fenico, sali di mercurio) rallentano i fenomeni putrefattivi. Bisogna tener presente che le alterazioni post-mortali sono prima biologiche e poi morfologiche e possono tutte ricondursi alla carenza di ossigeno o di sostanze nutritive. Già nel vivente le brusche variazioni di ossigeno provocano danni al reticolo citoplasmatico, ed ovviamente, in caso di anossia permanente, la prima struttura a risentirne gli effetti e proprio il reticolo citoplasmatico. L'integrità strutturale della cellula è compromessa quando il disordine funzionale è len­to e di lunga durata (malattie debilitanti), mentre lo è di meno quando la morte è veloce, e colpisce l'organismo in pieno benessere (morte per trauma).

Prima di parlare dei fenomeni autolitici, è opportuno specificare che questi sono proces­si esclusivamente enzimatici (almeno in teoria), e che non contemplano l'intervento di mi­croorganismi batterici; si tratta in definitiva di un'autodistruzione dei tessuti in stato di asepsi.

Le fasi dell'autolisi sono tre:

1) Chimico-fisica - determinata dai disordini metabolici provocati dall'anossia.

2) Chimica - dovuta alla lisi delle componenti cellulari.

3) Morfologica - quando le alterazioni regressive sono riscontrabili prima microscopi­camente e dopo anche macroscopicamente.

La fase chimico-fisica inizia con la mancanza di ossigeno, cui segue la mancanza di metaboliti. Pertanto le cellule, accumulando cataboliti acidi, subiscono un abbassamento del pH. L'aumento dell'acidità causa un'alterazione degli equilibri idro-salini, e tutti questi fattori provocano una sorta di intossicazione cellulare autogena.

La fase chimica si risolve nella lisi enzimatica dei lipidi, che vengono idrolizzati in acidi grassi e glicerolo, dei carboidrati, che si trasformano in acido piruvico e acido lattico e delle proteine, che vengono scisse in aminoacidi. L'ulteriore degradazione degli aminoaci­di ad opera delle peptidasi è sempre opera di microorganismi.

Le alterazioni più precoci della fase morfologica consistono in deformazioni mitocondriali (rigonfiamento) e vacuolizzazione dei nuclei, che diventano più chiari per migrazio­ne della cromatina verso la periferia del nucleo.

A livello dei tessuti abbiamo le seguenti alterazioni:

- // tessuto muscolare - i muscoli striati presentano dapprima un impallidimento delle fi­bre, seguito poi da un'accentuazione della striatura trasversale. Quest'ultimo fenomeno è osservabile anche a livello del miocardio.

- Organiparenchimatosi - per qualche ora presentano alterazioni irrilevanti, per cui una indagine istochimica deve essere eseguita in tessuti prelevati subito dopo il decesso. Chia­ramente la permanenza degli organi in ambienti a bassa temperatura rallenta ulteriormen­te il progredire dei fenomeni autolitici. La temperatura di -20°C permette l'esecuzione di fini tecniche istochimiche anche dopo parecchi giorni dalla morte , e dopo un mese ed oltre sono possibili ancora molte colorazioni istologiche.

A temperatura ambiente però, dopo qualche ora c'è precipitazione delle proteine va­cuolizzazione del citoplasma e picnosi nucleare. Gli stati patologici degli organi, inoltre, concorrono ad accelerare i processi degenerativo-necrotici.

- Rene - si osserva dapprima un rigonfiamento della capsula di Bowmann, seguita da un ammassamento degli epiteli dei tubuli contorti prossimali, che si staccano dalla membrana basale, ed infine uno sfasamento di questi ed un ulteriore allargamento della capsula

- Tessuto nervoso - si osserva lisi dapprima a livello della corteccia cerebrale parietale e temporale, ed in particolar modo a livello dei neuroni piramidali. Le cellule gliali degene­rano più tardivamente dei neuroni.

- / tessuti connettivi - degenerano in misura molto inferiore dei parenchimi, e la loro de­gradazione è dovuta generalmente a fenomeni putrefattivi.

In base a quanto abbiamo detto risulta che un'indagine istologica è più agevole di una istochimica, perché, rispetto alle alterazioni biochimiche, quelle morfologiche sono relativamente più tardive.

Il prelievo nell'animale da esperimento può essere effettuato anche subito dopo (o durante) il decesso, mentre su materiale umano si può disporre solo di biopsie intraoperatorie perché dopo l'accertamento della morte siamo già entrati quasi nel pieno della fase morfologica della degenerazione. I cadaveri infatti possono essere esaminati solo dopo un certo tempo (Regolamento di Polizia Mortuaria, R.D. 21/'XII. 1942, n. 1880, arti. 7 e segg), ed è pertanto molto difficile eseguire indagini istochimiche su frammenti autoptici umani.

 

Capitolo IV

LA FISSAZIONE

Dopo il prelievo, il tessuto va incontro a processi degenerativi che vanno sotto il nome di autolisi, e che consistono in profonde alterazioni del tessuto stesso. La rottura delle membrane lisosomiali dopo la morte provoca la liberazione di enzimi autolitici, che in pra­tica «digeriscono» la cellula provocandone la distruzione. Altre precoci alterazioni riguardano i mitocondri, che vanno incontro ad un rigonfiamento per imbibizione di acqua questo processo, oltre che dopo la morte del tessuto, è osservabile anche in alcune malattie. Questa degenerazione mitocondriale, detta anche rigonfiamento torbido o degenera­zione albuminoidea, si ha nel vivente in casi di ipossia o di anossia del tessuto, nelle intos­sicazioni ed in alcune malattie infettive.

Allo scopo di impedire questi processi si procede alla fissazione, che consiste nel sotto­porre il frammento prelevato all'azione di sostanze chimiche che, denaturando le proteine impediscono la lisi enzimatica.

Compito essenziale della fissazione è quindi quello di preservare l'identità strutturale del tessuto bloccando l'autolisi enzimatica. Può capitare però che questo processo, pur impedendo l'autolisi, alteri le strutture tissutali, per cui è buona norma ricorrere a quei fis­sativi che blocchino gli enzimi ma che allo stesso tempo abbiano la proprietà di alterare so­lo minimamente il tessuto stesso.

Per ottenere una buona fissazione occorre osservare alcune norme: in primo luogo biso­gna notare che un fissativo penetra nel tessuto dall'esterno verso l'interno, per cui il pote­re fissante diminuisce man mano che ci si avvicina verso il centro del frammento preleva­to. Un frammento eccessivamente spesso può quindi presentare disomogeneità di fissazio­ne dovuta a scarsa penetrazione della sostanza fissante. Si rende necessario a questo punto limitare al massimo lo spessore del frammento, sempre ovviamente in rapporto al tipo di esame da eseguire. Per le normali osservazioni è sufficiente uno spessore medio di 1/2 cm, anche se la superficie può essere relativamente ampia.

Altro parametro da controllare è la temperatura. Tutti gli enzimi, per funzionare, han­no un optimum termico, e la loro attività decresce proporzionalmente alla temperatura. Per eseguire una fissazione ideale sarebbe necessario operare a + 4°C, perché questa tem­peratura, oltre a rallentare l'attività enzimatica, evita la formazione di cristalli di ghiaccio nell'ambito tissutale che potrebbero creare artefatti.

Molto importanti sono anche il pH e la pressione osmotica. Una concentrazione idrogenionica elevata (pH acido) provoca la frammentazione e la solubilizzazione delle proteine, che passano così nel liquido fissatore. Dato che tutti i liquidi fissativi tendono ad abbassa­re il pH, è opportuno usare sostanze tampone che mantengano costante la concentrazione degli ioni idrogeno.

Per quanto riguarda la pressione osmotica, è evidente che un fissatore deve essere isotonico con il frammento, in quanto una iperosmolarità provoca il raggrinzimento delle cellule, ed una ipoosmolarità ne provoca il rigonfiamento. Gli effetti negativi di un'alterazione della pressione osmotica sono molto evidenti nei preparati istologici. Allo scopo si usa di­luire il fissatore con soluzione fisiologica.

La fissazione può anche essere compromessa dalla natura del tessuto. Quanto più que­sto è compatto, tanto più difficile risulta la penetrazione del fissativo. Esempio tipico è dato dalla cartilagine, in cui si verifica quel particolare fenomeno denominato anelli del Liesergang, che consiste in una disomogenea penetrazione del fissativo nel tessuto, esitante nella caratteristica formazione di anelli.

Abbiamo accennato all'inizio che l'azione di un fissativo consiste nella denaturazione delle proteine; chimicamente avviene l'esclusione dell'acqua dal legame con le proteine stesse, in modo da bloccare i legami idrofili, attuando una vera e propria coagulazione proteica. Non tutti i fissativi però coagulano le proteine, anzi, i più importanti operano una sorta di gelificazione, che consiste nello stabilizzare le proteine mediante la formazio­ne di ponti (legame crociato nel caso della formalina).

In base a ciò possiamo fare una prima suddivisione dei fissativi in coagulanti e non coa­gulanti. A loro volta questi possono essere ancora ripartiti in additivi e non additivi, a se­conda se interagiscono solo con le proteine o con altre componenti tissutali. I fissativi ven­gono inoltre divisi in primari e miscele fissative.

FISSATIVI PRIMARI COAGULANTI

Agiscono sulle proteine formando legami molto stretti fra i loro gruppi idrofili, ed im­pedendo che questi vengano ad interagire con le molecole di acqua. In questo modo si im­pedisce agli enzimi (che sono proteine) di funzionare, in quanto essi agiscono sul substrato solo in presenza di acqua.

Alcool etilico

È un fissativo non additivo anidro molto penetrante, che coagula le proteine per rapida disidratazione. Non è un fissativo polivalente, in quanto la sua azione rapida coarta note­volmente il tessuto e provoca quindi alterazioni morfologiche. Per attenuare questo difet­to si usa adoperarlo diluito in concentrazioni crescenti. Ha una azione distruttiva sulle emazie, che risultano Usate, sui leucociti, che raggrinziscono, ed è inoltre un solvente dei grassi, per cui non è assolutamente indicato se si volessero studiare queste sostanze. Inol­tre la porzione periferica del tessuto, in seguito a rapida disidratazione, appare completa­mente priva di acqua e coartata.

Non fissa i glucidi, ma, poiché li lascia inalterati, viene molto usato associato ad altri fissativi quando si debbano eseguire colorazioni istochimiche per l'evidenziazione di que­ste sostanze. L'azione di rapida disidratazione e coagulazione delle proteine rende l'azione dello alcool simile a quella del calore.

Alcool metilico

Ha le stesse caratteristiche dell'alcool etilico, ed il suo uso in microscopia è limitato alla

citologia ematologica.

 Acetone

Anch'esso è un fissativo non additivo; possiede le stesse caratteristiche degli alcool, ma la rapida azione coartante e l'intenso indurimento del tessuto provocato da una fissazione di questo tipo, ne limita notevolmente l'uso.

Acido picrico (2,4,6 - trinitro fenolo)

È da considerare un fissativo additivo perché contrae legami con le strutture fibrose, del tessuto. Viene usato generalmente in soluzione satura miscelato ad altre sostanze, e rara­mente da solo. Non ha azione solvente sui lipidi, e, pur non fissando i carboidrati, trova applicazione nella evidenziazione del glicogeno. Dato che ha scarso potere di penetrazio­ne, non provoca indurimento del tessuto, ed è alla base quindi di molte miscele fissative. Forma dei sali (picrati) che necessitano di lavaggio in alcool per essere asportati, ed inoltre coarta molto il tessuto, per cui spesso è associato all'acido acetico che ne attenua questo effetto.

Triossido di Cromo

Si presenta sotto forma di cristalli rosso-bruni altamente idrosolubili; viene usato in soluzione allo 0,5-1%. È considerato additivo in quanto la sua azione coagulante delle proteine impedisce la digestione enzimatica dei protidi. È poco penetrante e necessita di un prolungato lavaggio, ma trova impiego nello studio del nucleo, del nucleolo e dei cromosomi in quanto, a differenza dell'alcool etilico, coagula anche le nucleoproteine. Una fis­sazione prolungata con triossido di Cromo ossida e rende insolubili i lipidi, e trasforma i glucidi in aldeidi. Dato che scioglie le proteine acide, rende scarsa l'affinità per i coloranti basici nei tessuti fissati. Chimicamente contrae legami crociati, ed inoltre da luogo alla reazione cromaffine, legandosi ai siti recettivi di particolari cellule (es: cellule entero-cromaffini della mucosa gastrointestinale e cellule del surrene).

Sublimato Corrosivo (Cloruro di Mercurio)

Additivo, si fissa ai gruppi aminici degli aminoacidi ed a quelli sulfidrilici della cisteina, formando dei ponti disolfuro. Interagisce con i lipidi tranne che con gli acetalfosfati, non reagisce con i glucidi, ma li conserva tramite la fissazione dei protidi. Provoca una mode­sta coartazione del tessuto, ma a livello cellulare si osserva raggrinzimento del citoplasma e distruzione dei mitocondri.

L'allontanamento del fissativo può essere fatto con acqua o con alcool etilico a 70-80°, anche se alcuni AA consigliano prevalentemente l'uno o l'altro metodo. È opportuno far seguire alla fissazione un trattamento con soluzione iodo-iodurata per allontanare i preci­pitati neri di mercurio metallico; si eseguono lavaggi con soluzione iodo-iodurata finché il colore dello iodio rimane persistente (giallo), e si elimina successivamente lo iodio in ecces­so, con lavaggio, in acqua con Metabisolfito di Sodio.

Preparazione della tintura iodo-iodurata: sciogliere 10 mi di ioduro di Na in 10 mi di acqua aggiungere 90 mi di alcool 95° + 1 gr. di iodio.

FISSATIVI PRIMARINON COAGULANTI

Agiscono stabilizzando le proteine mediante la formazione di ponti proteici che induriscono il gel senza allontanare l'acqua dalle cellule.

- aldeidi

Di questa numerosa classe di composti organici solo tre vengono usati come fissativi; es­si sono:

Aldeide formica

Aldeide glutarica

Acroleina

 Aldeide formica

L'Aldeide formica è un gas che in commercio si trova sotto forma di Formolo (chiamata più comunemente Formalina), una soluzione al 37-40% in acqua. Viene usata anche come disinfettante, in quanto la sua azione di bloccante enzimatico si esplica anche sui microor­ganismi patogeni.

In istologia ed istochimica viene usata ulteriormente diluita al 10%, per cui in definitiva avremo una soluzione di formaldeide al 4% in mezzo isotonico tamponante.

La sua azione fissativa si esplica mediante il legame che può contrarre con i gruppi colla­terali di alcuni aminoacidi, specialmente la lisina e la glutammina. Il legame consiste nella reazione con qualsiasi H libero, con la formazione di un particolare legame detto crociato, che provoca la liberazione di una molecola di acqua.

A pH acido la formalina può formare complessi anche con la tirosina (a temperature non basse) nonché ponti metilenici con la cisteina, tramite reazione con i gruppi sulfidrilici. Questa ultima reazione avviene a pH alcalino o, quando i gruppi SH siano in grande quantità, anche a pH neutro. L'acidità favorisce l'interazione con i gruppi amidici polipeptidici, mentre la debole alcalinità favorisce l'interazione con i gruppi aminici. È fonda­mentale sapere a questo punto che la formalina acidifica dopo un certo tempo, ossidando­si con l'ossigeno atmosferico con formazione di acido formico. Occorre quindi neutraliz­zarla con carbonato di Calcio o con un sistema tampone vero e proprio (vedi: Formalina neutra tamponata).

La Formalina forma nei tessuti un particolare pigmento detto ematina acida di Formali­na, simile all'emosiderina ma che non si colora con la reazione per il Ferro ed è birifrangente. Lillie ed Hershberger, con studi spettroscopici, hanno stabilito che la formazione dell'ematina acida di Formalina dipende solo apparentemente dall'azione della Formali­na, mentre in realtà dipende dall'azione combinata dell'aldeide con un acido, per cui si forma solo un'ematina acida piuttosto che un pigmento acido di Formalina.

In sostanza, quindi, l'azione della formalina sui tessuti si esplica modificando la natura chimica delle proteine, provocando così la denaturazione degli enzimi. Inoltre essa provo­ca l'unione di più molecole proteiche e ciò spiega l'indurimento del tessuto. Questa azione è facilmente spiegabile in quanto il legame crociato, che la Formalina effettua con i gruppi che hanno un H libero, può anche avvenire fra due molecole adiacenti, ed anche fra due H di una stessa molecola particolarmente ripiegata. Questo legame è solubile in acqua, per cui con prolungati lavaggi in acqua si possono rompere alcuni legami, inibendo l'effetto negativo dovuto all'azione della Formalina. Partendo da queste premesse è ovvio che la Formalina è un fissativo istologico e non citologico.

Aldeide Glutarica

Viene usata in particolar modo nella fissazione per perfusione e per preparati da esaminare al microscopio elettronico (M/E); presenta due gruppi aldeidici terminali e questi pos­sono anche reagire singolarmente con le proteine. Quando ciò avviene, il gruppo che rima­ne libero può interagire con le reazioni che eventualmente vengono usate per mettere in evidenza le aldeidi, ed in questo caso avvengono artefatti di fissazione. Normalmente la si usa diluita al 2%.

Acroleina

Usata prevalentemente per fissare tessuti da esaminare al M/E; è stata quasi del tutto sostituita dalla glutaraldeide.

Tetrossido di Osmio

È un fissativo che non si presta molto per l'inclusione in paraffina, in quanto è dotato di scarso potere penetrante; inoltre rende i tessuti friabili e non idonei al taglio. Facilmente alterabile è dotato di una elevata tossicità che, abbinata ad un costo elevato, ne limita mol­to l'uso in istologia classica.

Si fissa a strutture che hanno legami insaturi (lipidi e fosfolipidi) ed ha il pregio inoltre di fissare egregiamente i preparati citologici. L'Osmio metallico, impregnando i tessuti, li rende opachi agli elettroni, ed era impiegato con molto successo in M/E. Dato però che in­fluenza negativamente l'inclusione in metacrilato, è stato sostituito dalla glutaraldeide.

Acido Acetico

È un acido debole che non coagula le proteine e non provoca indurimento del tessuto; viene usato in miscele con altri componenti per questa sua proprietà. Grosso difetto dell'acido acetico è però quello di rigonfiare eccessivamente i tessuti, per cui è preferibile usarlo in soluzioni alcooliche. L'alcool, infatti, con la sua azione disidratante, contrasta efficacemente l'ipoosmolarità dell'acido acetico.

ALTRI   FISSATIVI  PRIMARI

Acetato di Piombo

Potrebbe essere usato per la fissazione dei mucopolisaccaridi acidi, ma il suo uso è limi­tato dal fatto che esso forma con l'anidride carbonica carbonati di piombo, insolubili, provocando quindi artefatti.

Sali

L'azione chimica di queste sostanze non è nota, essi vengono usati per lo più insieme a liquidi fissativi o miscele fissative (es: NaCl + Formalina).

MISCELE FISSATIVE

I fissativi esaminati, tranne la Formalina, raramente vengono usati da soli; si preferisce generalmente usarli legati ad altri elementi, sotto forma di miscele fissative. Scopo della miscela fissativa è quello di eliminare i difetti di un singolo fissatore, mediante l'azione più o meno antagonista di altre sostanze, oppure di potenziare le proprietà di un fissativo tramite l'azione sinergica di altre sostanze, oppure di creare affinità maggiori per un determi­nato tipo di tessuto o organo. Classico esempio è il liquido di Zenker.

In questa sede elencheremo solamente le principali miscele fissative usate per l'istologia e la citologia, tralasciando quelle adoperate in altre discipline scientifiche che fanno uso di tecniche microscopiche (es: Botanica e Zoologia).

Formalina Neutra Tamponata

Composizione:

Na2HPO4(fosfato sodico bibasico anidro) .......... 6,5 gr

KH2PO4 (fosfato potassico monobasico anidro) .... 4,0 gr.

HCHO (formaldeide al 40% )................. 100,0 mi

H2O distillata ............................... 900,0 mi

II pH della soluzione è 6,8-7 Metodo:

Porre i frammenti di tessuto in fissativo per 24h, cambiare la miscela e tenere i preparati in fissativo per altre 24h. I frammenti non debbono essere spessi più di 6 mm, poiché in questo caso aumenta il tempo di fissazione. Il rapporto volumetrico tessuto/fissatore deve essere 1/20.

Applicazioni:

La Formalina Neutra Tamponata può essere usata per fissare qualsiasi tipo di tessuto. Del meccanismo di azione della Formalina abbiamo parlato in altra sede, e ci limiteremo qui ad elencare i vantaggi che questa miscela comporta rispetto alla Formalina al 10%.

Con la Formalina Neutra Tamponata non si hanno i complessi con la tirosina, in quan­to questo legame richiede ambiente acido, ed inoltre si ha una reazione reversibile con i gruppi sulfidrilici, specialmente se questi sono presenti in grandi quantità. La reazione con i gruppi amidici, che è favorita dall'acidità, non avviene, mentre si ha la reazione con i gruppi aminici, favoriti dalla debole alcalinità.

Il fissaggio in formalina, che come sappiamo acidifica, provoca la formazione di un pig­mento, detto ematina acida di formalina. Questo pigmento, che all'osservazione può esse­re paragonato all' emosiderina, sembra dipendere dall'azione dell'acido e della formalina acida, ed ha le caratteristiche di essere birifrangente e di non reagire alle colorazioni per il Ferro. La formalina neutra tamponata non provoca questo artefatto. Inoltre la Formalina tamponata ha il vantaggio di coartare i tessuti molto meno di quella acida, e, come abbia­mo visto, interagisce di meno con le proteine tissutali.

Quando questo fissativo viene usato per conservare i tessuti, l'alterazione della concentrazione idrogenionica si è osservata solo dopo un anno e mezzo, e campioni fissati a pH 7 passavano dopo un anno a pH 6,6-6,8.

Liquido di Bouin

Composizione:

Soluzione acquosa di Acido Picrico .............. 150 ml

Formalina al 10% .............................. 50 ml

Acido Acetico Glaciale .......................... 10 ml

È opportuno tenere le soluzioni separate e mescolarle al momento dell'uso. Il liquido di Bouin è un ottimo fissativo, in quanto coarta poco i tessuti ed ha un potere penetrante ab­bastanza elevato che permette di fissare agevolmente grossi frammenti. Questo fissativo da ottimi risultati nella fissazione di feti umani interi.

La presenza di acido picrico impone il lavaggio in alcool per togliere il colore giallo che da quest'acido. Si consiglia di usare, invece dell'alcool a 50°, quello a 70°, eventualmente con l'aggiunta di poche gocce di carbonato di Litio in soluzione satura. Il lavaggio in al­cool deve proseguire fino alla totale perdita del colore. Il tempo di fissazione è di 12-48h.

Liquido di Zenker

Composizione:

Sublimato corrosivo ............................. 5 gr

Liquido di Muller ............................. 100 ml

Aggiungere prima dell'uso acido acetico (5 ml per 100 ml di fissativo).

Fissa da una a 24 ore, ma i frammenti più sottili sono fissati in 1-10 ore; lavaggio in ac­qua corrente per altre 24 ore. Dopo il lavaggio i pezzi vanno trattati con soluzione iodo-iodurata, come per ogni fissativo che contenga sublimato corrosivo. È importante che una delle dimensioni del pezzo non superi 1 mm. Era considerato uno dei migliori fissativi per il tessuto embrionale, ma attualmente è stato quasi del tutto sostituito dal liquido di Bouin. Resta comunque una delle migliori miscele fissative.

Bouin-Hollande

Composizione:

Acetato di rame ............................... 2,5 gr

Acido picrico cristallino ......................... 4,0 gr

Formalina ................................... 10,0 ml

Acqua distillata ............................... 100 ml

Acido acetico glaciale .......................... 1,5 ml

Si fa inizialmente una soluzione di acetato di rame ed acido picrico, si filtra e si aggiunge acido acetico e formalina. Questa miscela è una variante della soluzione di Rorheis dalla quale è stato eliminato il bicromato di potassio ed aggiunto acetato di rame ed acido picri­co. La fissazione è relativamente veloce, con un minimo di 8-10 ore fino a tre giorni; ri­chiede un lavaggio di qualche ora (fino a 12-13 ore) in acqua distillata.

Susa (o liquido di Heidenhein)

Composizione:

Soluzione A:

Sublimato corrosivo ............................ 4,5 gr

Cloruro di Sodio ............................... 0,5 gr

Acqua distillata .............................. 80,0 ml

Soluzione B:

Acido tricloro acetico ............................ 2 gr

Acido acetico ................................... 4 ml

Formalina .................................... 20 ml

Mescolare le due soluzioni al momento dell'uso.

È una miscela abbastanza valida per l'osservazione di preparati d'insieme, specialmente se debbono essere colorati con Ematossilina-Eosina (E-E). Fissa molto bene i nuclei, le strutture fibrillari ed il materiale embriologico. Il tempo di fissazione non deve superare le 14 ore, perché la presenza di sublimato può causare precipitati che comprometterebbero il buon esito dell'indagine. È una buona norma inoltre lavare in alcool a 70°-80°, come per tutti i fissativi con sublimato. L'aggiunta della soluzione iodurata deve essere fatta al primo lavaggio, mentre l'alcool deve essere cambiato più volte. Bisogna tener presente che questa miscela decalcifica i tessuti.

I liquidi fissativi trattati finora sono usati in genere per esaminare preparati d'insieme e trovano quindi applicazione in ogni campo dell'istologia. Elencheremo ora le miscele fissative da usare per singoli organi o tessuti o per singole sostanze.

FISSATIVI PER GLI ORGANI EMOPOIETICI

Liquido di Maximav

Liquido di Muller ............................. 100 ml

Formalina .................................... 10 ml

Sublimato corrosivo ............................. 5 gr

Acido Osmico al 2% ............................ 10 ml

Questo fissativo appartiene alla specie dello Zenker-Formolo, con l'aggiunta di acido Osmico. La formidabile azione fissativa del Muller ha fatto nascere una vera e propria fa­miglia di miscele fissative, che trovano impiego in molte metodiche istologiche. La fissa­zione avviene in circa 24 ore, ed il lavaggio in acqua corrente deve essere accompagnato da trattamento con soluzione iodo-iodurata, come per tutte le miscele contenenti sublimato.

Liquido di Helly

Liquido di Muller ............................. 100 ml

Sublimato corrosivo ............................. 5 gr

Formalina ..................................... 5 ml

Differisce dalla miscela precedente per l'assenza di acido Osmico; fissa in una o sei ore e richiede le stesse procedure di lavaggio della miscela di Maximov.

Questi fissativi vengono usati per lo studio degli organi emopoietici in quanto conserva­no molto bene la struttura nucleare e citoplasmatica.

FISSATIVI PER IL TESSUTO NER VOSO

Liquido di Muller

Bicromato di Potassio .......................... 2,5 gr

Solfato di Sodio ............................... 1,0 gr

Acqua distillata ............................... 100 ml

È preferibile sciogliere a caldo le componenti della miscela. Oltre ad essere molto indica­to per il tessuto nervoso e la mielina, trova impiego nella fissazione dell'osso.

Esplica la sua azione fissativa in giorni o settimane, e necessita di prolungato lavaggio in acqua corrente. Liquido di Carnoy (senza acido acetico)

Alcool 100° ................................... 65 ml

Cloroformio .................................. 35 ml

Fissa le cellule nervose, ed il tempo di fissazione varia a seconda dello spessore del pez­zo, calcolando che il potere di penetrazione è di circa 1mm/h. Necessita di lavaggio in al­cool.

FISSATIVI PER IL GLICOGENO

Liquido di Carnoy

Alcool 100° ................................... 60 ml

Cloroformio .................................. 30 ml

Acido acetico glaciale ........................... 10 ml

Non fissare per oltre 24 ore. È indicato anche come ottimo fissativo per la citologia. Do­po il lavaggio in alcool a 70°-80° (cambiato due volte) passare direttamente i pezzi in al­cool assoluto. I pezzi trattati con il liquido di Carnoy si conservano molto bene. Variante del metodo classico è il liquido di Gilson-Carnoy, che ha la stessa composizione, ma i tre componenti sono adoperati in parti uguali.

Il problema nella fissazione del glicogeno consiste nell'impedire la solubilizzazione, ma anche nell'evitare che esso venga asportato durante le fasi della preparazione dei tessuti per la colorazione. La formalina, per esempio, pur trattenendo il glicogeno durante il fis­saggio con la formazione di un reticolo proteinico (v: legame crociato), non riesce a man­tenerlo in situ durante le altre fasi.

Per fissare il glicogeno ci si avvale perciò di miscele a base di formalina e soluzione alcoolica di acido picrico, poiché quest'ultimo fissa il glicogeno mediante legame con i protidi. L'aggiunta di acido acetico inoltre, limita la coartazione tissutale provocata dall'acido picrico.

FISSATIVI PER LE GHIANDOLE

Sono molto efficaci i liquidi fissativi a base di sublimato (Zenker, Maximov, Suso, ecc.).

FISSATIVI PER I TESSUTI EMBRIONALI

Ottimi fissativi per i tessuti embrionali sono: il liquido di Zenker, il liquido di Bouin, il liquido di Heidenhein.

Come abbiamo detto all'inizio, scopo della fissazione è quello di impedire l'autolisi del tessuto, ma purtroppo ogni fissativo altera in maniera più o meno evidente le strutture tissutali. Per ogni tessuto, quindi, occorre saper scegliere il fissativo adatto, in modo da con­servare le strutture da studiare. Il diverso stato di idratazione dei tessuti provoca, durante la fissazione, lo spostamento delle strutture, con la formazione di spazi che, ad un'osservazione poco attenta, potrebbero sembrare reali. Tali sono, per esempio, i cosiddetti spazi di Grunhagen-Mingazzini, che si trovano nella mucosa intestinale al di sotto dell'epitelio di rivestimento, e che per molto tempo furono considerati normali. A seconda dell'entità della coartazione prodotta, questi spazi prendono il nome di lacerazioni o lacune.

Un tessuto fissato, naturalmente, non rappresenta mai l'immagine reale dello stesso tes­suto vivente, ma un'immagine 'equivalente', che riproduce però le strutture del tessuto in maniera abbastanza soddisfacente ed abbastanza standardizzabile. Quando invece, sia per errori tecnici che per cattive scelte di liquidi fissativi, le strutture risultano completamente sovvertite ed irriconoscibili, si parla di artefatti.

Molto spesso, nella pratica di laboratorio, occorre una ulteriore elaborazione dei prepa­rati fissati, e si rende quindi necessario un procedimento che permetta una più lunga con­servazione dei pezzi. Molti fissativi sono anche degli ottimi conservanti; nella tabella sono riportati i sistemi di conservazione dopo trattamento con i fissativi più comuni La terza fase dell'esecuzione dei preparati istologici è il lavaggio. Esso serve ad allonta­nare l'eccesso di fissativo, in modo da eseguire le procedure successive senza che si verifichino artefatti. La durata e il tipo del lavaggio dipendono dalla durata della fissazione e dalla qualità del fissativo. Nella elencazione dei fissativi abbiamo anche fatto cenno al tipo di lavaggio necessario ed alla sua durata.

DEC AL CIFICAZIONE

Questo procedimento si impone quando si ha a che fare con tessuti duri, la cui matrice inorganica potrebbe compromettere l'esecuzione dei tagli o delle sezioni, con irreparabili danni alla lama del microtomo.

Il metodo è diverso se si tratta di piccole concrezioni calcificate all'interno di un tessuto o di un tessuto calcificato (osso, dente etc.). Nel primo caso è sufficiente aggiungere picco­le quantità di acido Nitrico (1 % o 5%) o acido Formico concentrato al fissativo, badando di cambiare spesso la miscela, in quanto l'agente demineralizzante si consuma abbastanza velocemente.

Per lo studio di denti ed ossa, si preferisce usare agenti chelanti, tipo sali bi- e tetrasodici dell'EDTA (acido etilendiamintetracetico, o Versene). I chelanti hanno la proprietà di le­garsi a certi composti inorganici, fra i quali il Calcio.

Si ottengono buoni risultati usando l'EDTA al 5% prima della fissazione, per tempi lunghi che vanno da una settimana ad un mese o più, a seconda del contenuto in sali di Calcio. L'uso di decalcificante prima della fissazione è giustificato dal fatto che già l'ED­TA, indurendo i tessuti, attua una sorta di pre-fissazione.

Per accelerare il processo di demineralizzazione si può sottoporre la soluzione decalcifi­cante all'azione di una corrente elettrica continua (decalcificazìone elettrolitica).

 

 

Capitolo V

L'INCLUSIONE

Per includere un pezzo fissato e lavato è necessario eseguire due passaggi intermedi: la disidratazione e la diafanizzazione.

 DISIDRA TAZIONE

Come indica il termine stesso questo passaggio consiste nell'allontanamento dell'acqua dai tessuti fissati. Con questa metodica si raggiungono due scopi, che sono complementari tra loro.

Per prima cosa la disidratazione provoca un certo indurimento del tessuto che rende più agevole il taglio, ed in secondo luogo crea i presupposti per l'affinità con il mezzo inclu­dente, che come è noto non è solubile in acqua.

Il solvente che in istologia trova largo uso come disidratante è l'alcool etilico usato a concentrazioni crescenti. Abbiamo già parlato dell'azione disidradante dell'alcool etilico, tuttavia dobbiamo aggiungere le seguenti considerazioni.

Se il pezzo venisse passato direttamente dall'acqua di lavaggio all'alcool assoluto, la brusca diminuzione del contenuto idrico comporterebbe raggrinzimento e coartazione del pezzo, per cui se si vuole evitare questo inconveniente è bene che la disidratazione avvenga per gradi. Circa le modalità di questi passaggi, ogni Autore, rifacendosi alla sua esperien­za personale, riporta modi e tempi che possono essere in disaccordo con gli altri. Generalmente valgono però alcune regole di base:

il tempo di permanenza in disidratante è direttamente proporzionale alla grandezza del pezzo;

la quantità di disidratante è anch'essa proporzionale al volume del pezzo. La disidratazione si fa iniziare dall'alcool 70° o 80°, mentre la permanenza del pezzo deve essere prolungata nell'alcool a 90°. Un metodo generalmente accettato di disidratazione è il seguente:

- alcool 80° .................................. 2-3 ore

- alcool 95° .................................. 2-3 ore

- alcool 100° ................................. 1-5 ore

L'ultimo passaggio va ripetuto due volte, cambiando il solvente. Il preparato va tenuto nello stesso recipiente in cui è stato posto durante la fissazione, in quanto non si verificano assolutamente interferenze o inquinamenti fra le varie fasi.

L'esperienza ci ha insegnato che la disidratazione può anche essere eseguita secondo il seguente schema:

- alcool 95° .................................. 3-4 ore

- alcool 95° .................................. 3-4 ore

- alcool 100° ................................. 5-6 ore

- alcool 100° .................... anche un giorno o più.

A prima vista questo metodo potrebbe sembrare errato, ma occorre fare alcune conside­razioni:

in primo luogo, quando un frammento sottoposto a lavaggio viene immerso in alcool esplica un'azione diluente sullo stesso, per cui avremo che l'alcool 95° sarà circa 90° o me­no, a seconda del grado di idratazione del tessuto. La lunga permanenza nel secondo pas­saggio in alcool 100° è giustificata dal fatto che il pezzo è ormai completamente disidrata­to, per cui non c'è pericolo alcuno di provocare coartazioni tissutali. A volte i passaggi si eseguono giornalmente, tenendo i frammenti per più di 24 ore nello stesso solvente; nean­che in questo caso ci siamo trovati in difficoltà nelle fasi successive.

Oltre all'alcool etilico, esistono altre sostanze che vengono usate come agenti disidra­tanti: il butanolo, l'alcool isopropilico, il diossano, l'acetone etc. Di tutti questi si consi­glia di adoperare solo l'acetone, anche se a causa dell'alto potere di coartazione, i tempi e le diluizioni sono molto differenti rispetto a quelli usati per l'alcool etilico:

-Acetone30°.................................... 15'

- Acetone 50° .................................... 30'

- Acetone 70° ................................. 40-45'

- Acetone 90° ................................. 40-45'

- Acetone 100° ................................... 20'

(ripetere l'ultimo passaggio due volte, cambiando il solvente).

Con questo metodo si ottengono buoni risultati se i passaggi vengono effettuati in frigo­rifero a +4°C. L'acetone è molto usato per la microscopia elettronica.

DI'AFAN1ZZAZIONE

II tessuto ormai completamente disidratato deve essere incluso in paraffina, ma poiché questa sostanza è insolubile sia in acqua che in alcool occorre eseguire un procedimento in­termedio che abbia funzione di ponte fra questi due passaggi. È necessario quindi un solvente che allontani l'alcool dal tessuto ma che allo stesso tempo crei le condizioni di affini­tà con la paraffina, che sia in ultima analisi un solvente di questa; gli idrocarburi benzenici hanno questa proprietà. I più usati nella pratica di laboratorio sono lo xilolo, il toluolo ed il benzolo.

Pur se lo xilolo trova impiego dappertutto, il toluolo è da preferire, in quanto indurisce i tessuti molto meno. Il benzolo, pur penetrando più dello xilolo e del toluolo, non è molto agevole da usare, in quanto il suo basso punto di ebollizione (80° C) lo rende estremamen­te volatile e quindi facilmente evaporabile. L'evaporazione può portare alla penetrazione di aria all'interno del tessuto, con spiacevoli conseguenze all'atto del taglio e dei successivi passaggi.

Il pezzo si tiene in diafanizzazione per 2-3 ore, sempre nel recipiente originario (di vetro o, almeno, di plastica chimicamente resistente). La diafanizzazione è così chiamata perché alla fine il preparato appare diafano, opalescente e di consistenza gommosa ai bordi. Il ri­lievo di questa caratteristica consente di stabilire se la reazione è avvenuta o meno, poiché se la regione centrale del preparato rimane opaca significa che il tessuto non è stato com­pletamente disidratato. La presenza di una disidratazione incompleta è anche indicata dal permanere di un alone biancastro alla periferia del preparato. A questo punto si prende il pezzo e lo si pone di nuovo in alcool assoluto per allontanare i residui di acqua eventual­mente rimasti. Dopo aver disidratato e diafanizzato i pezzi si procede per l'inclusione, che consiste nell'imbibizione del preparato da parte di una sostanza inerte che faccia da supporto per le successive operazioni di taglio. Per essere tagliato al microtomo, occorre che il preparato sia incluso in un mezzo che non sia né troppo duro, perché potrebbe causare dannosi sbri­ciolamenti, né troppo molle, perché provocherebbe arrotolamenti; occorre quindi dispor­re di un mezzo di consistenza media che sia agevole da tagliare. I vari tipi di paraffina sono dei mezzi di inclusione ideali.

L'inclusione può essere fatta in paraffina, celloidina, gelatina e glicol polietilenici (Car-bowachs). L'inclusione in resine, oltre che per il M/E, può essere fatta anche per il micro­scopio ottico; nelle tabelle (2-5) sono esposti i vari metodi di inclusione.

Per quanto riguarda l'inclusione in paraffina questa consta di due momenti: 1) imbibi­zione (o colata) in paraffina molle a 37°C e 2) l'inclusione vera e propria, in paraffina du­ra a 56-60°C. L'esperienza nella tecnica istologica insegna però che non è opportuno ese­guire la colata con paraffina molle in quanto si possono verificare, involontariamente, delle sostituzioni di paraffine, con spiacevoli incidenti all'atto del taglio. È preferibile, quindi, usare sempre lo stesso tipo di paraffina. La prima fase, che dura 12-24 ore, deve essere eseguita in termostato a 60°C, ponendo il pezzo in appositi recipienti contenenti pa­raffina liquida. In questo modo si ottiene la completa imbibizione del preparato, perché il toluolo evapora facilmente e cede il posto alla paraffina. In seguito si pone il preparato, previamente orientato a seconda degli scopi, in un apposito stampo in cui si è colata prece­dentemente paraffina liquida, e si lascia solidificare a T° ambiente o, meglio, in frigorife­ro a 4°C. Una volta solidificata, l'inclusione è pronta per essere tagliata al microtomo. Al­lo scopo di riconoscere i vari blocchetti è buona norma introdurre un piccolo cartellino con i dati essenziali per l'identificazione.

Automazione - Con l'esclusione della fissazione, tutti i procedimenti sopra esposti posso­no essere fatti automaticamente. Esistono degli apparecchi, (Autotechnicon) nei quali i passaggi necessari per la disidratazione, la diafanizzazione e l'inclusione vengono eseguiti in un cestello comandato da un meccanismo ad orologeria, che regola la durata fra i vari passaggi: il tutto dura 24 ore. L'inclusione negli appositi stampi viene eseguita a mano, di­sponendo però di un erogatore di paraffina con il quale si riempiono gli stampi. Macchine più sofisticate, comunque, sono anche in grado di eseguire questo passaggio.

 

 

Capitolo VI

IL TAGLIO

Per poter essere osservato al microscopio il frammento di organo deve essere tagliato in fettine sottili, in modo da permettere il passaggio dei raggi luminosi, che in ultima analisi sono quelli che rendono possibile l'osservazione del preparato. Per ottenere queste sezioni ci si avvale di strumenti di taglio denominati microtomi (micro-temno = taglio piccolo). Ci sembra superfluo in questa sede parlare delle varie tecniche per eseguire corrette sezioni microtomiche, in quanto l'acquisizione di abilità al taglio, per ogni tipo di microtomo, è solo frutto di esperienza, e non può essere trasmessa teoricamente. Ci limiteremo ad esporre solamente i vari tipi di microtomi, ed i loro ruoli nella tecnica di Anatomia Micro­scopica. I vari tipi di microtomo sono:

a)       a slitta - è il tipo più comune, e può essere a pezzo fisso e a lama mobile o viceversa. Consta di un supporto portaoggetti dove si inserisce il blocchetto dell'inclusione, e di una slitta dove è assicurata la lama. L'innalzamento del portaoggetti è assicurato da una manopola micrometrica che può essere regolata manualmente o manovrata auto­maticamente. A seconda dell'abilità dell'operatore, permette anche di ottenere sezio­ni di 1 micron.

b)   rotativo o senatore, o di Minot - Questo microtomo è a lama fissa ed a pezzo mobile. Il preparato viene avvicinato alla lama mediante un dispositivo a manovella (come le comuni affettatrici da cucina). Anche qui l'avanzamento del portaoggetti è assicurato da una manopola micrometrica, che permette di lavorare agevolmente solo se mano­vrata automaticamente. Con questo tipo di microtomo si eseguono sezioni seriale quando si ha la necessità di avere una ricostruzione tridimensionale del pezzo.

c)    congelatore - permette l'esecuzione di sezioni su pezzi freschi, cioè non inclusi. Pre­senta il vantaggio della velocità di esecuzione (è infatti usato per le biopsie estempora­nee che si eseguono in corso di .intervento chirurgico), ma ha diversi inconvenienti, quali la coartazione del tessuto per la improvvisa perfrigerazione e la disomogeneità delle sezioni, poiché le componenti di un tessuto hanno punti crioscopici differenti. Il congelamento si ottiene tramite un getto di CO2 gassosa. Le sezioni ottenibili hanno uno spessore di 20-25 micron.

d)   criostato - parte dal principio del congelatore, ma è costituito da una camera a —20°C dentro cui è situato un microtomo, con i comandi all'esterno. Il congelamen­to del pezzo si può ottenere prima ancora di introdurlo nel criostato, tramite getti in­termittenti di Freon, ma un congelamento graduale è preferibile a quello brusco. Nei criostati più moderni è possibile ottenere un congelamento rapido ed un'omogeneità di taglio, con sezioni che possono essere sottili anche 2-4 micron.

LAME

È superfluo dire che la qualità di una sezione dipende dalla lama, e soprattutto dallo sta­to di manutenzione di questa. Tutti coloro che operano al microtomo sanno quanto sia preziosa una lama, ed è quindi necessario evitare abrasioni anche minime che ne possano compromettere la funzionalità.

Esistono diversi tipi di lame, che si differenziano le une dalle altre per la differente affi­latura; avremo quindi:

a) lame biconcave

b) lame piano-concave

c) lame a facce piane

d) lame bipiane con faccetta

Per le inclusioni in paraffina si preferisce usare la lama bipiana, mentre per il microto­mo congelatore è preferibile la lama bipiana con faccetta; il criostato è fornito di lame par­ticolari. Una lama grande è da preferire ad una piccola, se non altro perché è più stabile e vibra di meno, risultando così più precisa. Ogni microtomo possiede un supporto reggi-lama regolabile, di modo che l'inclinazione rispetto al pezzo può essere regolata a discre­zione dell'operatore.

ESECUZIONE DEL TAGLIO

Dopo aver posto l'inclusione sull'apposito portaoggetti e dopo aver regolato lo stru­mento, si inizia il taglio. Dopo ogni sezione è opportuno porre un cubetto di ghiaccio sul blocchetto, perché l'attrito provocato dalla lama sull'inclusione genera calore e quindi dilata la paraffina, per cui le sezioni successive possono essere più spesse di quanto si sia programmato. Eseguito il taglio si deposita la sezione in una vaschetta contenente soluzione fisiologica (o acqua distillata) a temperatura ambiente; questa operazione va eseguita con un pennelletto ed aiutandosi con specilli, in quanto la sezione rimane adesa sulla lama. Con lo stesso specillo ed un pennelletto si procede alla distensione della fettina, onde evita­re la formazione di pieghe che renderebbero difficile la lettura al microscopio.Indi si im­merge il vetrino in un bagnomaria termostatato a circa 40-44° C per completare la disten­sione, si pone il vetrino sull'apposito cestello portavetrini e si procede per la fase successi­va.

La paraffina che rimane sul vetrino con la sezione di tessuto deve essere asportata, in quanto ostacolerebbe la colorazione del preparato.

Per fare ciò si immerge il cestello portavetrini in una bacinella di Schiefferdecker conte­nente xilolo (o toluolo) e si agita per qualche secondo; poi si sottopongono i vetrini all'azione di una corrente di aria calda in modo che possano asciugare e si ripete il bagno nella bacinella con lo xilolo; si ripete il procedimento con l'aria calda, e si pongono i vetri­ni in una seconda bacinella con xilolo. A questo punto la sparaffinatura è avvenuta, ma per procedere alla colorazione occorre che i preparati siano di nuovo idratati, per creare affinità con le sostanze coloranti, che in genere sono in soluzione acquosa. Dalla seconda bacinella contenente xilolo, dove i vetrini permangono qualche secondo, si passa quindi senza asciugare ad una serie di bacinelle contenenti alcool 100°, alcool 100°, alcool 95°, alcool 90°. Questa serie, detta serie discendente degli alcool, assicura la reidratazione ne­cessaria. I passaggi vanno eseguiti per pochi secondi ciascuno, agitando il cestello. Per to­gliere l'eccesso di alcool dai preparati si immerge il cestello in un recipiente con acqua di fonte, e si agita finché non scompaiono le tracce di alcool. A questo punto il preparato è pronto per essere colorato.

A colorazione avvenuta, specie se si tratta di colorazione regressiva, si procede ad un prolungato lavaggio in acqua, che per alcuni coloranti serve addirittura da viraggio (v. Ematossilina). Indi si esegue il montaggio in balsamo.

Il montaggio richiede una nuova disidratazione del preparato, in quanto la resina non è idrosolubile; si procede quindi come per la idratazione, solamente che il passaggio nelle bacinelle avviene in senso inverso rispetto alla fase precedente. Si passa in pratica alla sca­la ascendente degli alcool,

Dopo immersione nello xilolo si prendono i vetrini coprioggetto e vi si pone una goccia di balsamo diluita con una goccia di xilolo. Si poggia il vetrino sulla sezione delicatamen­te, e lo si lascia aderire al vetrino portaoggetto. Infine si asciuga con carba bibula per due volte, facendo attenzione a non premere troppo per non spostare il coprioggetto. Una vol­ta asciugato il preparato è pronto per essere osservato e si conserva indefinitamente.

 

 Capitolo VII

I COLORANTI

La capacità dei coloranti di legarsi ad una o più sostanze è determinata dal fatto che essi posseggono dei gruppi molecolari responsabili del colore (gruppi cromofori), ed altri gruppi, definiti auxofori, che si legano chimicamente con il preparato in esame.

I colori originano dall'assorbimento più o meno intenso delle radiazioni luminose, ma non tutti i composti colorati sono però coloranti, per cui si rende necessario l'uso di so­stanze che aumentino questa capacità.

II colorante deve avere la proprietà di legarsi con il suo gruppo auxoforo al preparato da colorare permeando il materiale, e rimanendo dentro e su di esso. Il solo legame con il gruppo auxoforo però non da la visione del colore per cui è necessaria la presenza del gruppo cromoforo inoltre che legandosi con un composto aromatico (anilina, benzolo, antracene) forma il gruppo cromogeno, che in pratica è quello che da il colore caratteristico ad ogni colorante.

In genere la maggior parte del colorante resta alla superficie del preparato in esame. La tonalità che noi osserviamo al microscopio è la luce riflessa e non quella assorbita.

Un colorante si differenzia da un altro per la specificità verso particolari strutture, ma sono importanti anche la concentrazione del colorante ed il tempo di reazione. Oggi si ten­de a classificare le colorazioni in tre gruppi:

a)   colorazioni chimiche.

Si basano sull'interazione fra sostanza colorante e substrato, ed obbediscono alle leg­gi che regolano i legami chimici. Di questo tipo di colorazione se ne parlerà quando ci occuperemo dell'Istochimica.

b)   Colorazioni fisiche.

Avvengono indipendentemente dall'affinità che il colorante può avere per la sostanza da colorare, per cui obbediscono a leggi fisiche. Il colorante infatti non viene assunto per legami che avvengono fra determinanti chimici presenti fra le due sostanze, ma piuttosto perché è solubile nel composto da colorare, e riesce quindi a diffondere in esso ed imbibirlo, penetrando nelle lacune dei tessuti. Classici esempi di colorazione fisica sono il Sudan per i lipidi, le colorazioni per il connettivo (van Gieson) e l'impre­gnazione argentica.

c)    Colorazioni chimico-fisiche.

Sono di gran lunga le più numerose. Data la loro origine empirica, non si conoscono i meccanismi attraverso i quali si attuano, con precisione, e si è prospettata l'ipotesi di due meccanismi di assorbimento:

assorbimento elettrico: questa possibilità è suggerita dal fatto che i coloranti hanno una struttura polare, così come i tessuti da esaminare. Si verrebbe a creare in definiti­va, con un meccanismo analogo all'idrolisi salina, un equilibrio idroelettrolitico fra colorante e tessuto. Ovviamente, se il pH delle proteine tissutali è maggiore del punto isoelettrico, queste reagiranno con coloranti basici, da cui la dizione di proteine basofile, cioè acide; se invece il pH è inferiore al punto isoelettrico si parlerà di proteine acidofile, cioè basiche.

assorbimento superficiale: una sostanza con superficie rugosa può trattenere un'altra sostanza perché riesce ad imprigionarla fra le sue anfrattuosità; su questo principio si basa l'assorbimento superficiale, in quanto in questo caso non entrano in gioco forze elettropolari. La sola tensione superficiale, che varia da una sostanza ad un'altra, provoca assorbimento superficiale.

Queste diverse modalità di assorbimento - chimica la prima e fisica la seconda - sono presenti in questo tipo di colorazioni.

A volte, per alcuni tipi di colorazioni, si rende necessario l'uso di sostanze che facciano da ponte fra tessuto e colorante. Queste sostanze sono chiamate mordenti o mordenzanti, ed il processo è definito mordenzatura. Il mordente è capace di legare al tessuto gruppi aci­di o basici, che a loro volta potranno reagire con coloranti basici o acidi. Le sostanze mor­denzanti generalmente usate sono acidi o sali metallici (ac. Picrico, tetrossido di Osmio) oppure sostanze ossidanti (ac. cromico, sublimato corrosivo ecc.) oppure sali di allume. Questi ultimi vengono detti isomorfi, in quanto pur sostituendo l'Alluminio nell'allume naturale non ne modificano la struttura cristallina. A seconda dell'uso dei coloranti le colorazioni possono essere divise in:

a)    Semplici - quando si faccia uso di un solo colorante.

b)   Progressive - quando il colorante venga fatto agire fino ad avvenuta colorazione.

 c)    Regressive - quando si effettua dapprima una sovracolorazione, dopodiché si sotto­pone il tessuto a lavaggio per togliere l'eccesso di colorante.

d)   Simultanee - quando ad agire sul tessuto è una miscela composta da più di una sostan­za colorante.

e)    Successive - quando i coloranti vengono usati consecutivamente, e ad intervalli più o meno lunghi.

f)    Metacromatiche - quando uno stesso colorante tinge in maniera differente strutture diverse di uno stesso tessuto, in base a trasformazione dei suoi costituenti molecolari. Per questo tipo di colorazione si usano in genere composti chimicamente puri.

g)    Dirette - senza aggiunta di sostanze mordenzanti.

h)   Indirette - con mordenzatura; queste colorazioni sono più stabili. Possono essere ese­guite in un tempo, mescolando colorante e mordenzate (laccatura), o in due tempi ap­plicando separatamente le due sostanze.

i)    Differenziate - dopo la colorazione regressiva si effettua una seconda colorazione semplice atta a differenziare le strutture.

 

Ematossilina

È un colorante naturale che si estrae dal legno di campeggio; la sostanza pura è incolore, ed affinchè acquisti un gruppo molecolare cromoforo necessita di ossidazione ad emateina. L'ossidazione, o maturazione, può avvenire sia naturalmente (ossidazione all'aria) che per mezzo di ossidanti chimici (KMnO4, KC1O4, KCrO7 etc.). L'affinità tintoriale, però è acquisita dopo l'interazione con una sostanza mordente (o mordenzante), con la quale forma una lacca; generalmente la mordenzatura si effettua con un sale di Allume, per cui avremo in definitiva che la sostanza colorante è un emallume.

Bisogna tener presente che questa lacca ha un pH superiore a 3, ma, dato che le caratte­ristiche tintoriali si manifestano a pH minori, è necessario aumentare il pH con un lavag­gio prolungato in acqua corrente, che in questo caso funge da viraggio oltre che da diffe­renziazione, stabilizzando il colore,

Ematossiline di uso comune:

Emallume di Meyer - esiste in commercio in soluzione acquosa (Merck*). È una Ematossilina di uso generale nella routine di ogni laboratorio istologico.

Ematossilina di Ehrlich -

Composizione: Ematossilina ............................ gr 2

Alcool 96° ........................... ml100

Acqua distillata ....................... ml 100

Glicerina ............................. ml 100

Allume potassico ........................ gr 3

Acido Acetico ......................... ml 10

Sciogliere l'Ematossilina nella soluzione formata dai restanti componenti e far maturare per almeno due settimane.

Emallume Corazzi -

Composizione: Ematossilina .......................... gr 0.5

Allume potassico ....................... gr 25

Acqua distillata ....................... ml 400

lodato potassico ...................... gr. 0.1

Glicerina bidistillata ....................ml 10

Si scioglie a caldo l'Allume in 350 ml di acqua, quindi, a soluzione avvenuta, si aggiunge l'Ematossilina. A raffreddamento avvenuto si mescola questa soluzione con un'altra for­mata dallo Iodato + 50 ml di acqua e si aggiunge la glicerina. La miscela non necessita di maturazione ed ha il pregio di non creare eccessi di colorazione, oltre a essere più elettiva delle altre verso i nuclei.

Ematossilina di Harris -

Composizione: Ematossilina ............................ gr 1

Alcool 100° ........................... ml 10

Allume potassico ....................... gr 20

Acqua distillata ....................... ml 200

Ossido di Mercurio ..................... gr 0.5

Preparare la soluzione di Ematossilina, alcool ed acqua, quindi aggiungere l'ossidio di mercurio dopo 24 ore. Questa soluzione è molto usata in citologia, sia per il metodo di Papanicolau che di Harris-Shorr.

Ematossilina ferro-cloridrica di Weigert -

Composizione: sol. A Ematossilina ............................ gr 1

Alcool 96° ........................... ml 100

Sol. B

Percloruro di Ferro .................... gr 1.16

Acqua distillata ........................ ml 98

Acido cloridrico ......................... ml 1

preparare separatamente le due soluzioni, quindi mescolarle al momento dell'uso.

La miscela dovrà essere di colore nero. Mentre le soluzioni madri A e B si conservano molto a lungo, la miscela può essere usata al massimo per 6 giorni, ma i risultati migliori si ottengono entro i primi tre giorni.

Violetto di Genziana

Composizione: Violetto di Genziana ..................... gr 1

Alcool 90° ............................ ml 15

Acqua distillata ........................ ml 80

Olio di Anilina .......................... gr 3

Ottimo colorante nucleare, è molto usato nella batteriologia.

Carminio

È un colorante naturale che si ricava da coccinelle femmine disseccate in ragione di 1 Kg ogni 1400 animali. Colora sotto forma di lacca in maniera analoga all'Ematossilina. Le formule di uso più comune sono:

Carmallume -

Composizione: Carminio ............................... gr 1

Allume ammoniacale ..................... gr 3

Acqua distillata ....................... ml 100

Si porta la soluzione ad ebollizione, si lascia raffreddare e si filtra. Dato che la soluzione ammuffisce con facilità si consiglia di aggiungervi 1 mi di formalina o qualche cristallo di Timolo. Colora i nuclei in rosso (1-24 ore).

Paracarminio -

Composizione: Carminio ............................... gr 1

Cloruro di Alluminio ................... gr 0.5

Cloruro di Calcio ........................ gr 4

Alcool 70° ........................... ml 100

La soluzione si prepara a bagnomaria, quindi si lascia depositare e si filtra. Al momento dell'uso si aggiunge alcool 70° in ragione di 5:1, e si acidifica con 2 gr di acido acetico per 100 ml di soluzione. Colora più intensamente del Carmallume.

Carminio di Rawitz -

Composizione: Carminio ............................... gr 2

Allume ammoniacale .................... gr 20

Acqua distillata ....................... ml 150

Glicerina ............................. gr 150

Si fa bollire la soluzione acquosa di Carminio ed allume, indi si lascia raffreddare, si ag­giunge glicerina e si fa bollire di nuovo. Dopo tre giorni occorre filtrare la soluzione, che è pronta per l'uso. Colora in circa 10'.

Fucsina

Possiamo suddividere questa famiglia di composti chimici in: fucsina acida, basica, sol­forosa e fenofucsina.

Per le colorazioni nucleari si adopera principalmente la fucsina basica, che è parte inte­grante di molte colorazioni: Cajai-Gallego, PAS, Feulgen, Mallory, Pianese, Biondi-Heidenhein etc. Nella colorazione dei nuclei la fucsina ha le stesse modalità di impiego del­la Safranina.

Safranina

Colorante azinico che può essere usato sia indipendentemente che in associazione con altri coloranti. È molto affine alla cromatina nucleare, per cui trova applicazione anche per l'evidenziazione dei cromosomi.

Formula di Pfitzner -

Composizione: Safranina ............................... gr 1

Alcool 100° (o 95°) .................... ml 100

Aggiungere ml 200 di acqua distillata dopo 48 ore dall'esecuzione della soluzione. Come l'Ematossilina, migliora invecchiando.

Altri coloranti nucleari sono: Gallocianina, Vesuvina (Bruno Bismarck) Cresilvioletto, Verde di Metile (specie per il DNA) etc.

I coloranti citoplasmatici sono generalmente derivati acidi dell'anilina, e vengono usati per lo più in associazione con coloranti nucleari, anche se possono trovare applicazione (Eosina) quali deboli mezzi di contrasto nel corso di reazioni enzimatiche (v: Istochimica).

Eosina

Esistono di questo composto, appartenente alla famiglia delle fluoresceine, varietà solu­bili in acqua (Eosina gialla o Y) o in alcool (Etileosina o Eosina S). Una varietà particolare (Eritrosina B o iodo-Eosina) deriva dalla sostituzione del Bromo con Iodio ma è poco usa­ta. Si usa in soluzione acquosa all'1 % e colora le strutture in rosso-arancio.

Grange G

È usato nelle colorazioni di Azan e Mallory al posto dell'Eosina, alla diluizione dello 0.5%. Colora in rosso-arancio e chimicamente contrae legame con la tirosina ed il triptofano. È un ottimo colorante delle strutture connettivali.

Cromotropi

Affini all'Orange G, sostituiscono l'Eosina nella colorazione delle strutture citoplasmatiche. Le proprietà tintoriali variano a seconda della soluzione usata (Chromotrop 2R = citoplasma rosso brillante). Vengono usati in soluzione alcoolica a concentrazioni variabìl (2R = 1%).

Altri coloranti citoplasmatici sono in genere i coloranti acidi, fra i quali: Rosso solido Azofloxina, Blu di anilina, Azzurro Lione, Blu di Metile, Fucsina acida etc..

 

Capitolo VIII

COLORAZIONI ISTOMORFOLOGICHE

A seconda delle proprietà dei componenti le miscele coloranti possono essere divise in istomorfologiche ed istochimiche. Le prime servono ad evidenziare le caratteristiche morfologiche dei tessuti in esame, mentre le seconde danno una localizzazione topografica del­le costituenti delle cellule.

Le colorazioni istomorfologiche possono essere divise in:

1) Colorazioni totali

2) Colorazioni per il tessuto connettivo

3) Colorazioni per i tessuti duri ed il tessuto muscolare

4) Colorazioni per il tessuto nervoso

5) Colorazioni per il tessuto emopoietico

6) Colorazioni per il sangue.

Le metodiche istomorfologiche applicate all'indagine citologica sono riportate nel capi­tolo di tecniche citologiche.

1) COLORAZIONI TOTALI

Ematossilina - Eosina Soluzioni:

Emallume di Meyer

Eosina allo 1 % in acqua distillata Metodo:

Sparaffinare e reidratare le sezioni

Lavare in acqua

Ematossilina per 15'

Acqua corrente 6-8'

Eosina 30" Lavare brevemente in acqua

disidratare, chiarificare, montare in balsamo.

Risultati: nuclei e sostanza fondamentale della cartilagine in blu; citoplasma, connettivo ed eritrociti in rosso o rosso arancio.

Ematossilina - Grange

Procedere come per Ematossilina-Eosina, tranne sostituire l'Orange G allo 0.5% all'Eosina. I risultati sono quasi identici.

2) COLORAZIONI DEL TESSUTO CONNETTIVO

L'istologia insegna che il tessuto connettivo è costituito da elementi cellulari (fibrociti), fibre (reticolari, elastiche, collagene) e sostanza fondamentale, oltre che da elementi reticolo-istiocitari e leucocitari. Mentre gli elementi cellulari si colorano anche con i meto­di generali, le fibre necessitano di un terzo colorante che le metta bene in evidenza. Queste tecniche sono definite tricromiche e le fibre possono anche essere evidenziate con le tecni­che fisiche dell'impregnazione con sali d'argento e d'oro.

COLORAZIONI TRICROMICHE

II nucleo si evidenzia generalmente con una lacca, mentre le strutture citoplasmatiche e connettivali debbono essere evidenziate facendo agire simultaneamente due coloranti acidi con proprietà diverse. Il primo ha la caratteristica di penetrare rapidamente nelle strutture più fini (Ac. Picrico, Grange G, Metilarancio etc.), mentre il secondo ha una penetrazione più lenta, e quindi inizialmente colora le strutture più grossolane (fucsina acida, blu di me­tile, verde luce, etc.). Se si interrompe la colorazione quando il secondo colorante non è ancora penetrato nei tessuti, si verifica che questo è riuscito solamente a legarsi alle forma­zioni più grossolane, riempiendo però gli spazi vuoti del tessuto a spese del secondo colo­rante.

Per ottenere una buona colorazione tricromica, quindi, occorre che il secondo colorante non abbia la possibilità di sovraccolorare il preparato; ciò si ottiene facendo agire la solu­zione per brevissimo tempo.

IMPREGNAZIONE

La tecnica di impregnazione con sali di metalli pesanti, a seconda del metodo adopera­to, permette la dimostrazione delle fibre reticolari, o fibre argirofile, delle fibre collagene, delle neurofibrille, della mielina, della nevroglia etc..

Si tratta in pratica della deposizione di sali metallici (Argento) sulle componenti tissutali mediante precipitazione, con successiva riduzione allo stato elementare da parte di un agente ossidante. Il risultato è dato dall'annerimento provocato dalla deposizione del me­tallo. La reazione avviene in tre tempi:

-deposizione del sale metallico

-riduzione con rimozione del metallo ridotto

-deposizione (controllata di altro metallo, con un meccanismo comparabile al procedi­mento fotografico).

Metodo di Van Gieson

Soluzioni: Miscela di Van Gieson:

Ac. Picrico in sol. Acquosa satura ... .ml 100

Fucsina acida (1 %) .................. ml 10

Metodo:

Sparaffinare e reidratare le sezioni

Lavare in acqua

Ematossilina di Weigert 4-8'

Sottrarre l'eccesso di colore in acqua distillata

Miscela di Van Gieson 30"

Lavaggio in acqua distillata

Disidratare, chiarificare, montare in balsamo

Risultati: nuclei neri, tessuto connettivo in rosso, fibre muscolari e citoplasma gialli. La colorazione col tempo perde d'intensità.

Picro-Ponceau ed Ematossilina di Weigert (secondo Gurr)

Soluzioni: Piero Ponceau:

Ponceau S (sol. Acquosa \%) .......... 10 ml

Ac. picrico sol Acquosa satura ......... 86 ml

Ac. Acetico sol. Acquosa all'I % ......... 4 ml

Metodo:

-Sparaffinare e reidratare le sezioni

-Ematossilina di Weigert 4-8'

-Sottrarre l'eccesso di colore in acqua distillata

 -Picro-Ponceau 4'

-Lavare in acqua distillata

-Disidratare (la presenza di acido picrico impone un'attenta disidratazione per aspor­tare eventuali picrati formati dall'acido che non ha preso parte alla colorazione), chiarificare, montare in balsamo.

Risultati: nuclei neri, tessuto connettivo in rosso, fibre muscolari e citoplasma gialli, così pure epiteli e fibre elastiche.

Azan-Mallory (secondo Heidenhein)

La dizione Azan sta ad indicare azocarminio e blu di anilina. Probabilmente è una delle più efficaci colorazioni per il tessuto connettivo, ed è una variante della colorazione di Mallory, rispetto alla quale ha il pregio di colorare più intensamente ed in modo migliore. Il fissativo più indicato è il Susa, anche se vanno bene tutti quelli a base di sublimato.

Soluzioni - Azocarminio.:

Azocarminio G ...................... gr 0.1

Acqua distillata ..................... ml 100

Portare ad ebollizione, filtrare ed aggiungere:

Acido acetico ........................... ml 1

- Anilina alcoolica:

Olio di Anilina ........................ ml 0.1

Alcool 96° ........................... ml 100

- Alcool acidulato:

Alcool 96° ........................... ml 100

Acido acetico ........................... ml 1

- Soluzione di Azan:

Blu di anilina idrosolubile ............... gr 0.5

Grange G (o Grange III) .................. gr 2

Acido acetico ........................... ml 2

Acqua distillata ....................... ml 100

Bollire, far raffreddare e filtrare.

Metodo:

-Sparaffinare e reidratare le sezioni

-Azocarminio 10' a 56°C, poi lavare in acqua distillata

-Differenziare in anilina alcoolica fino a colorazione rossa dei nuclei

-Interrompere la differenziazione con alcool acidulato per 1 '

-Mordenzatura in acido folsfowolframico (soluzione acquosa al 5%) per 3-6 ore

-Lavaggio rapido in acqua distillata

-Soluzione di Azan 1'-2' (se diluito 1:3 in acqua tenere per due ore)

-Lavare in acqua distillata e differenziare in alcool 95°

-Disidratare, chiarificare, montare in balsamo.

Risultati: fibre connettivali reticolari e collagene in azzurro; nuclei, tessuto muscolare, cellule ed emazie in rosso arancio.

Metodo di Weigert alla resorcina-fucsina per le fibre elastiche

Soluzioni - Miscela di Weigert:

Resorcina .............................. gr 4

Fucsina basica ........................... gr 2

Acqua distillata ....................... ml 100

Percloruro di Ferro al 20% .............. ml 25

Alcool a 96° .......................... ml 200

Acido cloridrico ......................... ml 4

La miscela è disponibile in commercio già pronta. Si fa bollire in acqua la resorcina e la fucsina, si aggiunge il percloruro di Ferro e si fa bollire per altri 5'. Dopo raf­freddamento si filtra la soluzione con carta bibula, si raccoglie il precipitato (diretta­mente nel filtro) e si fa bollire di nuovo nell'alcool, con le dovute cautele. A raffred­damento avvenuto si filtra di nuovo e si aggiunge acido cloridrico. La soluzione si mantiene solo per 2-3 mesi.

Metodo:

-Sparaffinare le sezioni fissate in miscele a base di sublimato o alcool

-Portare direttamente in Weigert per 15'-30' a 56°C

-Lavare in acqua distillata

-Differenziare in alcool etilico a 80°

-Lavare in acqua distillata

-Eseguire una colorazione per il connettivo allo scopo di colorare le strutture restanti

(es.: Van Gieson).

Risultati: le fibre elastiche si colorano bruno-nero.

Impregnazione argentica del connettivo secondo Gomori

Soluzione di Gomori:

AgNO3 al 10% ......................... ml 10

KOH al 10% .......................... ml 10

H2O ............................. Diluire 1:1

Metodo:

-Sparaffinare le sezioni fissate in formalina

-Ossidare in permanganato di K 0.5-1% per 1-2'

-Lavare in acqua corrente per 5'

-Metabisolfito di K ali'1-3% per 14'

-Lavare in acqua corrente per 10'

-Trattare con allume ferrico al 2% per 1' (preparazione estemporanea)

-Acqua corrente per 3-5'

-Acqua distillata (cambiata due volte) per 2'

-Soluz. di Gomori (Ag ammoniacale) per 1'

-Acqua distillata per 5-10"

-Ridurre con formalina al 10% per 5-10'

-Acqua corrente per 5'

-Virare con Cloruro d'Oro allo 0,1-2% per altri 10'

-Breve lavaggio in acqua distillata cambiata due volte

-Metabisolfito di K ali'1-3% per 1'

-Tiosolfato di Na all'1% per 1'

-Acqua corrente per 5-10'

-Disidratazione, chiarificazione e montaggio in balsamo

Risultati:

(v: impregnazione). Questo metodo è tra i più usati in quanto, se eseguito correttamen­te, da sempre risultati ottimi.

3) COLORAZIONI PER I TESSUTI DURI ED IL TESSUTO MUSCOLARE

I tessuti duri (previa decalcificazione) ed il tessuto muscolare possono essere colorati sia con l'Ematossilina-Eosina che con i metodi per il tessuto connettivo.

4) COLORAZIONI PER IL TESSUTO NERVOSO

Per studiare il Sistema Nervoso è necessario impiegare diversi tipi di colorazioni istolo-giche, poiché nessuna di esse, da sola, è in grado di evidenziare tutte le componenti strut­turali di tale sistema, che è il più differenziato dell'organismo.

I metodi più frequentemente usati sono quelli dell'impregnazione argentica, che sfrutta­no l'argirofilia delle cellule nervose e dei loro prolungamenti (dendriti e cilindrassi).

Le metodiche per lo studio del Sistema Nervoso possono essere sostanzialmente divise in due gruppi: tecniche per lo studio dei neuroni e tecniche per lo studio delle fibre nervose Queste ultime comprendono i metodi per l'evidenziazione delle guaine mieliniche (metodo di Pal-Weigert), delle sinapsi (metodo di Bielschowsky, metodo di Bodian) e dei nodi di Ranvier. Fra i metodi per studiare il decorso delle fibre nervose meritano un cenno parti­colare quelli per le fibre nervose degeneranti. Queste reazioni (di Marchi, di Guillery, di Nante e Gygax) si basano sul dato sperimentale che la mielina normale non contiene neteri del colesterolo né trigliceridi, mentre la mielina in degenerazione contiene acido linoleico. I doppi legami presenti negli acidi grassi reagiscono con l'osmio mono-, bi- e triossi-10, riducendolo ad osmio metallico, che è di colore nero. Oltre a permettere lo studio di casi patologici di lesioni nervose, queste tecniche consentono di indagare su lesioni indotte sperimentalmente sull'animale da laboratorio, in quanto la reazione dell'osmio metallico è visibile nel preparato dopo 8 giorni dall'esperimento, e cessa dopo un mese.

Le principali metodiche di indagine istologica per lo studio del Sistema Nervoso sono le seguenti:

Colorazione di Nissl

Colora i nuclei dei neuroni e la sostanza tigroide e può essere eseguita seguendo metodiche diverse. Nelle tabelle 7 e 8 sono riportati il metodo diretto (colorazione acida e neutra) sia il metodo con mordenti; qui esporremo il cosiddetto 'metodo rapido'.

Soluzioni:

Tampone Acetato:

Acetato di sodio ...................... 1 p 5 ml

Acido acetico al 1.20% ................... 4 pp

Cresil Violetto ......................... gr 0.5

Sciogliere il cresil violetto in tampone

Metodo:

-Sparaffinare le sezioni

-Cresil violetto (o tionina) 10'

-Lavare i vetrini in tampone acetato (pH 4)

-Disidratare, chiarificare (brevemente), montare in balsamo

Risultati:

nuclei e sostanze tigroidi in violetto, cellule nervose bleu pallide e le restanti strutture

incolori.

Metodo di Olivecroma per le guaine mieliniche

Soluzioni: Ematossilina di Weigert

Soluzione A ............................ 3 pp

Soluzione B ............................ 1 pp

Metodo:

-Sparaffinare le sezioni (15 micron) immerse in alcool 40°

-Ematossilina di Weigert per 15-20'

-Lavaggio in acqua distillata

-Lavaggio in acqua corrente per 15' fino ad avere una colorazione blu

-Differenziazione nella soluzione B

-Lavaggio in acqua corrente per 15'

-Rapida immersione in acqua distillata

-Disidratare, chiarificare, montare in balsamo

Risultati:

 guaine mielinche blu-notte

Metodo di Spielmeyer per le guaine mieliniche

Soluzioni - Ematossilina alcoolica:

Ematossilina ........................... gr 10

Alcool 100° .......................... ml 100

Acqua distillata ............ 95% della soluzione

Preparare l'Ematossilina alcoolica e diluire con ac­qua distillata previa maturazione di sei settimane.

Metodo:

-Tagliare al criostato sezioni di preparati fissati in formalina

-Mordenzatura per 6 ore in allume ferrico al 2.5%

-Lavare in acqua di fonte

-Porre i vetrini in alcool ed agitare per 10'

-Ematossilina alcoolica per 2-6 ore

-Lavare in acqua corrente per 5'

-Differenziare in allume ferrico al 2.5%

-Lavare per 2 ore in acqua distillata

-Disidratare, chiarificare, montare in balsamo

Risultati: questo metodo colora solo le guaine mieliniche, che risultano nere; le restanti strutture avranno tinta giallastra, le fibre demielinizzate non prenderanno il colorante.

Metodo di Del Rio-Ortega per la glia (modificato da Bairati)

Soluzione ammoniacale di Argento:

Nitrato di Argento ...................... gr 10

Carbonato di sodio ...................... gr 5

Si preparano le soluzioni di Ag al 10% e di carbonato di Na al 5%. Si prendono 5 mi della prima e si aggiungono a 20 mi della seconda. L'unione di queste due soluzioni forma un precipitato giallo che deve essere disciolto aggiungendo ammoniaca goccia a goccia con una pipetta. Dato che il pH della soluzione deve essere inferiore a 11 si accelera la dissolu­zione del precipitato con piridina, anch'essa somministrata goccia a goccia.

Metodo:

I preparati dovranno essere freschi e fissati in formalina acida (pH 1.5-2.5). Per corregge­re eventuali aumenti di pH aggiungere bromuro di ammonio, controllando il pH

-Eseguire sezioni criostatiche di 25-30 micron

-Lavare in acqua distillata

-Trattare con soluzione ammoniacale di carbonato di Ag per 15' a 60° C, oppure per 1

ora a T° ambiente

-Lavare in acqua distillata per pochi secondi (2")

-Ridurre con formalina al 10% (in capsula di Petri). Le sezioni dovranno apparire

giallo-grigiastre. Togliere dalla formalina prima che questa intorbidisca

-Lavare in acqua di fonte

-Disidratare, chiarificare, montare in balsamo

-viraggio in cloruro d'oro all'1% per 10-15"

-fissare con iposolfito di sodio al 5% per 1'

-lavare, disidratare etc.

 Risultati: La glia si colora di nero, le restanti strutture in bruno-giallastro o chiare.

Metodo di MARCHI per le fibre nervose degeneranti (secondo Herman e Bernstein)

1) Fissare piccoli frammenti di tessuto nervoso in degenerazione in una soluzione di potassio bicromato al 3% per circa 10-15 giorni.

Evitare di esporre il preparato alla luce durante la fissazione.

2) Dopo la fissazione immergere i preparati direttamente nel liquido di Marchi:

tetrossido di osmio (sol. acquosa allo 0,5%) ........ 11 ml

clorato di potassio (sol. acquosa all'1%) .......... 16 ml

formalina..................................... 3 ml

acido acetico (soluzione acquosa al 10%) ........... 3 ml

acqua distillata ................................ 67 ml

Il rapporto liquido/pezzo dovrà essere 1/20, ed è consigliabile cambiare giornalmente la posizione del pezzo, in modo da permettere al liquido di penetrare uniformemente nel tessuto. La durata del trattamento è di 1-2 settimane.

3)Lavare in acqua corrente per 24 ore.

4)Disidratare in alcool a concentrazioni crescenti, diafanizzare in cloroformio ed includere in paraffina.

5)Tagliare le sezioni al microtomo.

6) Sparaffinare e montare in resina disciolta in cloroformio.

Risultati: mielina in degenerazione, nera; grassi neutri, neri; background, giallo chiaro.

Metodo di CAJAL

E' considerato uno dei migliori metodi per l'evidenziamento della nevroglia.Richiede la massima attenzione nell'esecuzione, ed è di fondamentale importanza che i prodotti adoperati siano della massima purezza. È denominato anche metodo all'oro;ed  i reattivi adoperati sono il cloruro d'oro ed il sublimato corrosivo.

- Metodo di GLEES

E un metodo all'impregnazione argentica poco diffuso, sebbene dia buoni risultati nella evidenziazione dei bottoni sinaptici e delle neurofibrille. Un grosso limite di questa tecnica è l'evidenziazione sia delle sinapsi normali che delle sinapsi in degenerazione.

- Metodo di GOLGI-COX

E' un ottimo metodo all'impregnazione argentica per l'evidenziazione delle cellule nervose. Pur non evidenziando le strutture interne del neurone, questa tecnica fornisce dettagli completi della superficie cellulare, e dei rapporti fra il pirenoforo ed i prolungamenti dendritici e neuritici.

- Metodo di PAL-WEIGERT

Colora elettivamente le guaine mieliniche, fornendo un buon contrasto fra le guaine stesse ed i tessuti circostanti. Non colora la mielina in degenerazione. Originariamente i preparati venivano fissati con il liquido di Muller, ma attualmente si preferisce la formali­na al 10%. Di questa tecnica esistono diverse varianti.

 

5 )COLORAZIONI PER IL TESSUTO EMOPOIETICO

I componenti del tessuto emopoietico sono il midollo osseo, la milza, i linfonodi ed il ti­mo. Generalmente i metodi elettivi per colorare questi organi sono: Eosina-Azur di Maximow, Acido periodico - Schiff (PAS) ed un metodo combinato per l'elastina, il collagene e le fibre reticolari. Esporremo qui solamente il metodo di Maximow, in quanto il PAS verrà trattato tra i metodi istochimici, mentre per gli altri metodi si rimanda al paragrafo delle colorazioni per il tessuto connettivo.

Soluzioni - Eosina - Azur:

Eosina gialla (Y) in tampone di Wright (0.1 %) ....... ml 8

Azur II in tampone di Wright 0.1 % ................ ml 4

Tampone di-Wright 0.1% ........................ ml 2

Acqua distillata ................................ ml 40

Tampone di Wright:

Fosfato monobasico di potassio ................. gr 6.63

Fosfato Basico di sodio ........................ gr 3.20

Acqua distillata .............................. ml 1000

Preparare la soluzione acquosa di Eosina e tampone di Wright, quindi aggiungere l'Azur

II agitando vigorosamente.

Metodo: Fissare in Zenker-Formolo per 30-60'

-Lavare in acqua corrente (nel caso si tratti di midollo osseo) o in bicarbonato di potas­sio al 3% (per i tessuti larghi più di 3 mm) per tutta la notte

-Includere in paraffina e sezionare al microtomo

-Sparaffinare e reidratare

-Ematossilina per 30-45"

-Virare in acqua corrente per 8-10'

-Sciacquare in acqua distillata

-Eosina - Azur per tutta la notte

-Lavare in acqua di fonte

-Disidratare, chiarificare e montare in balsamo

Risultati: i nuclei si colorano in porpora scuro, le emazie in rosa chiaro, i granulociti eosinofili in rosso ed il citoplasma in blu pallido

6) COLORAZIONI PER IL SANGUE

Le indagini istomorfologiche su materiale ematico si effettuano mediante strisci di san­gue sul vetrino.

Tecnica dello striscio: con un apposito ago si punge il polpastrello del dito, si attende qual­che secondo e si fa pressione a monte del taglio fino a provocare la fuoriuscita di una goc­cia di sangue. Si deposita la goccia di sangue su un vetrino portaoggetti, e, con un altro ve­trino inclinato di 40° sul precedente, si comincia a strisciare la goccia. Si lascia asciugare all'aria per qualche minuto, indi si fissa in una miscela di alcool-etere, in parti uguali. I materiale fissato va poi colorato con il metodo panottico di Pappenheim che non è poi  altro che l'associazione delle colorazioni di May-Grunwald e Giemsa.

Metodo:

-Versare il colorante di May-Grunwald, disponibile in commercio, sul vetrino con una pipetta, fino a ricoprire lo striscio. Attendere 3' e versare acqua distillata goccia ,

goccia fino alla diluizione 1:2 del colorante. Tenere altri 6'

-Lavare brevemente in acqua distillata

-Colorare con il Giemsa, diluito 1 goccia 1ml di acqua distillata per 6', cambiando il colorante ogni 2'

-Lavare accuratamente in acqua distillata

-Lavare in benzene e montare.

Risultati: Nuclei: rosso-viola; granulazioni: in rosa (eosinofili), porpora (cellule linfoidi), marrone bluastro (neutrofili), blu (basofili).

 

 I MICROSCOPI

 Un sistema ottico riproduce un punto dell'oggetto come un piccolo disco luminoso, detto centrica, il cui diametro dipende dalla lunghezza d'onda della luce e dalla struttura dell'oggetto stesso. Due punti luminosi sono distinguibili solo se il bordo di una centrica non si sovrappone all'altra, o, al limite, se non supera il centro del cerchio.

La capacità di distinguere due punti luminosi più vicini possibile è definita potere di ri­unione, ed è in funzione del diametro e della distanza tra due centriche. Oltre a queste caratteristiche geometriche, il potere di risoluzione è in funzione anche dell'intensità della radiazione luminosa e delle caratteristiche del sistema rivelatore, cioè del contrasto. La risoluzione di un'immagine è legata quindi al contrasto: maggiore è il contrasto fra le sorgenti luminose più nitida sarà l'immagine. Molto spesso però il contrasto naturale non basta, per cui si ricorre alla colorazione dei preparati oppure si usano microscopi speciali.

MICROSCOPIO OTTICO COMUNE

Questo tipo di microscopio è composto da un sistema ottico, rappresentato dall'obbiettivo e dall'oculare, uno stativo, o parte meccanica, ed un apparato per la direzione e con­densazione della luce.

Schematicamente possiamo così rappresentarlo:

L'apparato di illuminazione del microscopio è formato dalla sorgente luminosa, che invia le radiazioni luminose, debitamente amplificate, dalla lente collettrice allo specchio, che la riflette sul campo visivo. Fra lo specchio ed il piano del preparato è posto un con­densatore, preceduto da un diaframma (d'apertura) che regola l'intensità della luce emes­sa dalla lampada con un sistema ad iride. Il condensatore è formato da lenti sovrapposte, che fanno convergere la luce al centro del preparato, sullo stesso asse del sistema ottico.

Il piano d'appoggio per i preparati è formato da una piastra generalmente quadrangola­re che, nei microscopi più moderni, è fornita di due manopole che ne permettono lo spo­stamento. Il piano subisce solo movimenti in senso antere-posteriore, mentre quelli latera­li sono resi possibili da un sistema di traslazione sovrapposto al piano, che mediante una o più levette, assicura la stabilità del vetrino.

Gli obbiettivi sono molteplici, e vengono fissati ad un revolver posto sotto il tubo dell'oculare. Ogni obbiettivo ha caratteristiche proprie ed infatti possiamo avere obbiettivi diversi per ingrandimento, da usare per l'osservazione ad immersione, per la fluorescenza etc. Essi sono caratterizzati da alcune cifre; per es.: 100X/l,25;oo/0,17 significa che l'im­magine è ingrandita 100 volte; l'apertura numerica è 1,25; la lunghezza del tubo dell'ocu­lare può essere infinita ed il vetrino coprioggetti non deve essere più spesso di 0,17 mm ( ± 0,01 mm). Il prefisso Gel indica l'uso ad immersione, e Fluor a fluorescenza.

Anche l'oculare reca delle cifre (es.: 12,5 X), che indicano l'ingrandimento dell'immagi­ne prodotto da esso. L'ingrandimento totale è dato dal prodotto dell'ingrandimento o dell'obbiettivo per quello dell'oculare. Es: Obbiettivo 25 x ed oculare 10 x daranno un in­grandimento totale di 250 x.

L'utilizzazione dell'immersione, mediante l'interposizione di olio di cedro fra la lente dell'obbiettivo ed il preparato, aumenta l'apertura numerica del microscopio, in quanto riduce la deviazione delle radiazioni luminose nel passaggio dal vetro del condensatore all'aria.

Questa metodica viene usata in genere per gli obbiettivi a grande apertura numerica.

MICROSCOPIO A CONTRASTO DI FASE E AD INTERFERENZA

Le onde luminose presentano tre caratteristiche: l'ampiezza, la lunghezza, la fase.

Nei preparati non colorati, l'ampiezza e la lunghezza delle onde che li attraversano subi­scono delle modificazioni non percepibili dall'occhio umano o da un'emulsione fotografi­ca, e quindi i preparati istologici in definitiva sono trasparenti alla luce visibile.

Esistono però delle piccole differenze nell'indice di rifrazione, che determinano une 'sfasamento' delle radiazioni trasmesse attraverso di essi. Nell'attraversare una cellula per es, le onde luminose che attraversano il nucleo saranno ritardate rispetto a quelle eh; passano nel citoplasma, e ne risulterà quindi un'onda sfasata. Nel microscopio a contras: : dì fase, queste piccole differenze di fase possono essere amplificate e trasformate in cambiamenti di ampiezza (luminosità).

Questo microscopio differisce da quello ottico comune solo per un diaframma posto sotto al condensatore (diaframma di fase o anulare) e per una lamina o anello di fase o ritardatore, posta all'interno dell'obbiettivo.

Il diaframma presenta a considerare una zona periferica ad anello, che è quella trasparente alla luce. Le radiazioni luminose, quindi, si concentreranno in questa zona, ed avremo che all'obbiettivo arriveranno sia i raggi diretti che quelli rifratti dalle strutture del preparato.

La lamina a sua volta accentuerà la differenza di fase, rendendo visibili le strutture microscopiche in quanto il ritardo di fase causa la differenza di ampiezza necessaria affinchè vengano percepite dall'occhio umano.

Il microscopio a contrasto di fase viene utilizzato per l'osservazione di preparati nei colorati e di cellule vive, ma ha il grosso limite di dare buone immagini solamente con preparati molto sottili, ed il suo uso è pertanto limitato alla morfologia.

Il microscopio ad interferenza si basa sul principio del contrasto di fase, ma la luce viene separata in due fasci ben distinti: uno formato dalla sola luce diretta, un altro dalla sola luce rifratta. Un apparato del microscopio ricombina i due fasci luminosi, creando così il fenomeno dell'interferenza. Questo è possibile in quanto i due fasci luminosi provengono dalla stessa sorgente, sono cioè coerenti. Questo microscopio, misurando il rallentamento dei raggi che hanno attraversato il preparato, o differenza di cammino ottico, permette di eseguire misurazioni quantitative delle componenti cellulari.

L'aumento della differenza di cammino ottico (= OPD = optical path difference) è provocata alle strutture solide, per cui, con procedimenti di estrazione, si possono misura­re le quantità di tutti i componenti chimici.

Usando un enzima proteolitico, per es., noi possiamo determinare la quantità di protei­ne cellulari (o tissutali) eseguendo determinate misurazioni prima e dopo l'estrazione enzi­matica: la differenza fra le due misure ci darà il contenuto di proteine.

MICROSCOPIO IN CAMPO OSCURO

Serve ad aumentare il contrasto sia in cellule viventi che in oggetti aventi diametro pic­colissimo, e quindi non apprezzabile con il comune microscopio ottico.

È costituito da un ordinario microscopio ottico cui il normale condensatore a luce tra­smessa è sostituito da un altro che illumina l'oggetto obliquamente.

L'aumento del potere di risoluzione si ha in base al fatto che particolari strutture colpite obliquamente, diffondono la luce in campo oscuro, aumentando la loro luminosità.

Il condensatore è composto da un diaframma nero centrale, che arresta i raggi luminosi diretti, mentre alla periferia rimane libera una zona che permette al fascio di luce, dopo essersi riflettuto sul condensatore, di dirigersi verso il centro dell'asse ottico secondo un an­golo ben determinato.

MICOSCOPIO POLARIZZATORE

Viene usato per osservare strutture che presentano un certo orientamento molecolare, quali le componenti fibrose o cristalline dei tessuti.

A causa del diverso orientamento delle molecole, quasi tutti i tessuti, non trasmettono la luce in tutte le direzioni in maniera uniforme, in quanto presentano indici di rifrazione di­versi. Quando tali tessuti sono colpiti da un raggio di luce polarizzata che si propaga in un unico piano, scindono la luce in due raggi perpendicolari fra di loro che si propagano con velocità diverse e che vengono definiti raggio ordinario e raggio straordinario.

I tessuti che hanno questa proprietà vengono definiti anisotropi o birifrangenti, quelli che invece presentano lo stesso indice di rifrazione in tutte le direzioni vengono definiti isotropi.

La differenza esistente fra questo tipo di microscopio e quello ottico comune consiste nella presenza di due dispositivi atti a trasformare la luce normale in luce polarizzata in un unico piano di propagazione. I due dispositivi sono posti uno sotto il condensatore (pola­rizzatore) e l'altro al di sopra della lente dell'obbiettivo (analizzatore), e consistono in due prismi di Nicol o due lamine di pellicola polaroid. Facendo ruotare l'analizzatore o il pola­rizzatore si ottiene la massima illuminazione del campo microscopico nella posizione in cui i piani di polarizzazione della luce trasmessa attraverso le due lamine sono paralleli tra loro. Si ottiene invece estinzione quando essi sono incrociati. Interponendo fra le due lamine un corpo birifrangente, questo apparirà illuminato anche in questa ultima condizione, in quanto esso scompone la luce nei due raggi perpendicolari ordinario e straordinario.

MICROSCOPIO A FLUORESCENZA

Un elettrone, colpito da una radiazione, aumenta la propria energia e passa ad un livello di energia superiore. Quando ritorna al livello iniziale l'energia accumulata viene trasfor­mata in radiazione luminosa visibile.

È questo il principio su cui si basa il microscopio a fluorescenza. Il preparato viene illu­minato con luce Ultravioletta, dirigendo sul campo un fascio di onde luminose comprese fra 300 e 400 mm di lunghezza d'onda. La luce U.V. non è visibile all'occhio umano; ado­perando però lunghezze d'onda dell'ordine di 350 mm avremo che la radiazione riemessa sarà visibile. La presenza di radiazione visibile viene eliminata interponendo filtri di ecci­tazione che assorbono tutte le radiazioni non U.V. (o blu o violette). I raggi non utilizzati nel processo di eccitazione vengono in seguito assorbiti da filtri di sbarramento. Si impiega in genere come sorgente luminosa una lampada a vapori di mercurio.

Fluorescenti sono le fibre elastiche ed il collagene, la vitamina A e tutti i carotenoidi, le lipofucsine (che non sono altro che lipocromi), etc. Questo tipo di fluorescenza autogena è detta autofluorescenza, mentre quella provocata tramite legame con un fluorocromo (v. immunofluorescenza) è definita fluorescenza indotta. Oltre ai fluorocromi (FITC, Roda-mina), possono indurre fluorescenza l'acridina Grange (RNA in verde e DNA in rosso), l'Alizarina, alcuni reattivi pseudo-Schiff e gli antibiotici a base di tetraciclina.

 

MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE

II principio del microscopio elettronico si basa sul fatto che un fascio di elettroni può es­sere influenzato da un campo elettrostatico o elettromagnetico. Questo strumento è l'uni­co che ci permette di analizzare l'intima struttura dei componenti intracitoplasmatici.

La sorgente luminosa è sostituita da un fascio di elettroni emessi da un filamento di tungsteno (anodo) ed accelerati sotto vuoto fino ad un determinato potenziale da un can­none elettronico (catodo). Il campo elettrostatico (o elettromagnetico), influenzando il cammino degli elettroni, funge da lente, facendoli convergere alla stregua di un raggio di

luce rifratto.

Gli elettroni non attraversano il preparato in maniera uniforme, ma vengono assorbiti dalle strutture cellulari a seconda della loro intensità e della loro opacità.

I campi magnetici fungono da obbiettivo e da oculare, permettendo così di visualizzare il preparato su uno schermo o su una emulsione fotografica.

Al microscopio elettronico non è possibile esaminare preparati freschi, in quanto il ma­teriale deve essere posto sotto vuoto. Si usa perciò fissare i tessuti generalmente con glutaraldeide o tetraossido di Osmio, e quest'ultimo agisce anche da colorante in quanto au­menta il contrasto dei costituenti cellulari agli elettroni, a causa del suo elevato numero atomico. L'Osmio ridotto si lega inoltre alle lipoproteine e ad altri componenti cellulari.

La disidratazione, in etanolo o acetone, è seguita da inclusione in resine epossidiche o in metacrilato. Il taglio viene effettuato con strumenti denominati 'ultramicrotomi' che per­mettono di eseguire sezioni dell'ordine di 200-400 A. Come lame si impiegano in genere

prismi di vetro o diamante, munite di una bacinella di raccolta per contenere le sezioni. Un ulteriore contrasto delle sezioni si può ottenere mediante l'impiego di 'coloranti elet­tronici' che sono sostanze contenenti atomi pesanti (acetato di uranile, citrato di piombo) i quali si legano ai diversi componenti della cellula, aumentandone così il contrasto.

MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE

Questo tipo di microscopio elettronico permette di esaminare la superficie degli organi, in quanto il fascio di elettroni viene riflesso dal preparato, che è ricoperto da una sottile pellicola di metallo (generalmente d'Oro).

Le asperità della superficie vengono evidenziate dalle diverse modalità di riflessione de­gli elettroni, che sono funzione della quantità di metallo presente in un determinato punto, che a sua volta dipende dalla morfologia della superficie.

Con questo metodo si ottengono immagini tridimensionali dei preparati in esame.

Il potere di risoluzione del microscopio elettronico a trasmissione è di circa 3-5 A (anche se in pratica è di circa 10 A). Ciò si traduce nella possibilità di ingrandire fotograficamente un oggetto fino a 1.000.000 di volte.

Il MES ha un potere di risoluzione inferiore, aggirandosi attorno ai 50-80 A. Teorica­mente il fascio di elettroni potrebbe essere accelerato fino ad ottenere ingrandimenti molto più elevati, ma occorre tener presente che un'eccessiva velocità di elettroni danneggerebbe il preparato.

 

 Capitolo X

INTERPRETAZIONE DEI PREPARATI AL MICROSCOPIO

L'interpretazione del preparato montato su vetrino è di esclusiva competenza del medi­co e non del tecnico. Nelle pagine che seguono forniremo perciò i dettagli inerenti ad una corretta «lettura» del preparato, soffermandoci però solamente ai principali tessuti. Per l'interpretazione dei preparati relativi ai diversi apparati (digerente, urinario, genitale etc.) si rimanda ai testi specialistici.

COME SI ESAMINA UN PREPARA TO

Ogni vetrino colorato e montato, per poter essere studiato, deve essere munito di una etichetta autoadesiva contenente i principali dati necessari alla sua identificazione. È sot­tinteso che l'osservatore, prima di iniziare la lettura del preparato, debba prima conoscere il significato dei dati riportati sull'etichetta. Un esempio di etichetta da apporre su un pre­parato può essere il seguente:

1—   Fegato; 2—   Ratto; 3—   Formalina 10%; 4—   4 micron; 5—   E-.E

Esaminiamo ora singolarmente i vari punti:

1 — Occorre innanzitutto familiarizzarsi con la morfologia e le funzioni dell'organo in esame. Nel nostro caso bisogna conoscere l'architettura del lobulo epatico, con particolare riferimento alla disposizione lamellare degli epatociti, alla localizzazione della vena centrolobulare e dello spazio porto-biliare. Quindi bisogna studiare le funzioni principali del fegato, e cioè: a) la funzione biligenetica, b) la funzione metabolica, e) la funzione protidosintetica etc.

2 — È molto importante conoscere la specie animale dalla quale è stata ricavata la sezio­ne di tessuto. Infatti esistono differenze strutturali a seconda della specie animale da cui il campione proviene.

È noto che la capsula fibrosa che riveste il fegato (scoperta la Laennec ma comunemente denominata «capsula di Glisson» o «Glissoniana») invia dei sepimenti all'interno del pa­renchima, e questi delimitano i lobuli epatici. Il lobulo epatico, in definitiva, sarà delimi­tato dai setti fibrosi della Glissoniana, per cui ne risulterà una struttura poligonale con gli angoli gli spazi porto-biliari ed al centro la vena centrolobulare, verso la quale convergono i cordoni unicellulari di epatociti.

Questo aspetto istologico, però, è facilmente evidenziabile solo nel fegato di maiale, mentre in preparati appartenenti ad altre specie, quali il ratto e l'uomo, il lobulo non è ben delimitabile al microscopio ottico. Lo spessore dei sepimenti connettivali, infatti, non ne permette in queste specie la chiara delimitazione. 3 — Conoscere il tipo di fissativo impiegato è importante, poiché, oltre al fatto che spes­so un tipo di fissazione prevede una determinata colorazione (es: Carnoy = PAS), il con­fronto dì preparati fissati in maniera differente permette all'osservatore di valutare e com­parare le eventuali differenze circa l'azione dei vari fissativi sulle strutture in esame.

4 — Lo spessore della sezione in esame indica sia lo scopo per il quale è stato eseguito il preparato che l'ingrandimento massimo con il quale si può osservare il vetrino. Una sezio­ne di 1-4 micron permette di osservare il preparato anche a forti ingrandimenti, per cui il vetrino consente l'osservazione di singole cellule; un preparato di 5-8 micron viene gene­ralmente eseguito per osservare le strutture connettivali, e permette anch'esso una buona risoluzione del microscopio; un preparato di spessore variabile fra i 10 ed i 50 micron è ge­neralmente usato nel campo dell'istochimica (enzimologia) e della neuroanatomia, e non consente osservazioni a forti ingrandimenti.

5 — Conoscere il tipo di colorazione significa individuare lo scopo per il quale è stato eseguito il preparato. La colorazione con il metodo dell'Ematossilina-Eosìna (E-E) indica che non si è voluto evidenziare alcuna struttura in particolare, mentre l'impiego di metodi­che specifiche sta ad indicare la necessità di evidenziare componenti specifiche del tessuto. Nel nostro caso, per es., se il fegato fosse stato colorato con un metodo all'impregnazione argentica, si sarebbero volute evidenziare le fibre connettivali reticolari. L'osservatore, in questo caso, avrebbe dovuto far passare in secondo piano tutti i particolari che non riguar­dano queste strutture.

COME SI INTERPRETA UN PREPARA TO

Un profano che avesse occasione di osservare un preparato istologico avrebbe sotto gli occhi un caleidoscopio di colori, cui non saprebbe dare alcuna interpretazione se non quel­la descrittiva delle varie tonalità cromatiche che gli si presenterebbero man mano che os­serva i vari campi del vetrino al microscopio. Nemmeno la sola conoscenza dell'Anatomia Microscopica è sufficiente ad interpretare i preparati istologici, perché bisogna tener conto di svariati fattori. In primo luogo bisogna considerare che i vetrini ci danno una visione bidimensionale del preparato, e che inoltre le variazioni dell'angolo di incidenza della lama del microtomo sulla superficie di taglio danno aspetti diversi di una stessa struttura.

A seconda dell'angolo di incidenza possiamo avere:

A) Sezioni trasverse - quando la lama colpisce il pezzo secondo un piano perpendicolare all'asse maggiore del medesimo.

B) Sezioni longitudinali - quando la lama colpisce il preparato secondo un piano parallelo all'asse maggiore.

C) Sezioni tangenziali - quando la lama colpisce il preparato secondo un piano parallelo all'asse maggiore, ma tangente alla parete.

D) Sezioni oblique - quando la lama colpisce il preparato obliquamente; queste ultime pos­sono essere di due tipi: a) oblique secondo l'asse minore, b) oblique secondo l'asse mag­giore.

In una stessa struttura possono verificarsi tutti e quattro i tipi di sezione, specialmente se si tratta di organi a decorso tortuoso (vasi, villi intestinali, dotti ghiandolari etc.).

Queste differenze non sono però osservabili in quegli organi che presentano una struttu­ra compatta ed omogenea, quali per esempio il fegato, la milza, i linfonodi e, in misura minore, la corticale del rene. In questi casi l'orientamento del pezzo non riveste importan­za rilevante, trattandosi di organi che hanno una struttura omogenea e parenchimatosa.

Particolare menzione meritano quelle lamine di tessuto epiteliale a decorso mammellonato contenute in organi cavi (vescica, colecisti, stomaco etc.). Capitolo XI

INTRODUZIONE ALLO STUDIO DELLA CITOLOGIA

Prima di affrontare lo studio degli strisci cellulari è opportuno fare alcune considera­zioni sui criteri da adottare per giungere ad una corretta interpretazione dei preparati citologici.

È fondamentale la 'sensibilità' e la 'specificità' dei metodi di colorazione adoperati, inoltre nell'uso del microscopio si devono seguire regole ben precise. È opportuno, in un'equipe di laboratorio, standardizzare i metodi di osservazione in modo da avere pres­sappoco gli stessi orientamenti diagnostici. Per esaminare un preparato citologico occorre tener presenti i seguenti parametri:

a)   Numero e tipo di cellule normali

La valutazione di questo tipo di cellule deve essere molto accurata, e si deve iniziare l'osservazione con una veduta panoramica, a piccolo ingrandimento.

b)   Presenza di eventuali cellule abnormi

II numero di queste cellule deve essere determinato a piccolo ingrandimento, come per le cellule normali.

e)    Disposizione delle cellule

In uno striscio citologico le cellule possono essere: isolate, disposte a formare aggre­gati.

La possibilità di ottenere l'uno o l'altro tipo di disposizione dipende dal metodo con il quale è stato eseguito lo striscio. Campioni di cellule ottenute con il metodo dell'aspi­razione, per esempio, sono generalmente più isolate che non quelle ottenute per abra­sione. Le cellule isolate, comunque, aumentano nei casi patologici gravi, perché l'evo­luzione in senso maligno sembra rallenti la coesione fra le cellule. Gli aggregati cellulari possono essere divisi in: strati, sincizi e grappoli. Gli strati sono agglomerati di cellule disposte regolarmente ed a limiti ben distinti. I sincizi sono formati da gruppi di cellule a disposizione irregolare ed a limiti indistinti e mal definiti; essi possono essere paragonati a veri e propri sincizi cellulari, originati come è noto dalla fusione di vari elementi cellulari che esitano in vere e proprie cellule giganti plurinucleate.

La cellula gigante originata dalla replicazione nucleare senza la corrispondente divi­sione citoplasmatica viene definita plasmodio.

La disposizione a grappoli (clusters degli A. A. anglossassoni) è caratteristica delle cel­lule epiteliali di origine ghiandolare, e si presenta come un raggruppamento tridimen­sionale a polarità alterata (le cellule ghiandolari hanno, come è noto, una polarità) ed a limiti mal definiti.

d)   Dimensioni delle cellule

Stabilire le dimensioni delle cellule non è cosa di scarso rilievo; d'altra parte è molto importante conoscere le normali dimensioni dei diversi tipi di cellule per poter coglie­re eventuali alterazioni di volume dovute a processi patologici, ma soprattutto per sta­bilire la provenienza di una cellula.

Come per tutti i tipi di misure, ci si avvale anche in questo caso di uno standard noto. Per la citologia vaginale, per esempio, si parte sempre dalla cellula superficiale, la cui area è all'incirca di 1500 micron2. 

e)  Forma delle cellule

È importante per riconoscere sia il tipo cellulare che lo stato funzionale. Ovviamente la forma di una cellula varia se si esamina un preparato istologico o un preparato citologico. La diversità è data dalla presenza di forze (tensione superficiale, pressione da parte di cellule contigue, viscosità del citoplasma etc) che rivestono notevole impor­tanza quando le cellule si trovano nel loro ambiente naturale, ma che cessano quando esse ne escono, come per esempio in caso di esfoliazione. Weibel ha paragonato le cel­lule a bolle di sapone, che assumono un aspetto poliedrico quando sono a mutuo con­tatto le une con le altre ma che diventano rotonde (rounding-up) quando sono isolate, quando cioè vengono a mancare le forze di coesione intercellulari. Nel caso che i preparati ottenuti senza alterare la forma originale delle cellule può essere agevolmente riconosciuta anche in un preparato citologico. In base alla forma le cellule possono essere divise in: poligonali, rotonde, ovalari, colonnari o cilindriche, irregolari (divisibili in fusate e caudate).

 f)Inclusioni citoplasmatiche

possono essere di due tipi : endogene ed esogene. Le prime (proteine, carboidrati, pigmenti, granuli di secreto, etc) sono sostanze prodotte dalla cellula stessa; le seconde provengono dall'ambiente esterno alla cellula e vengono inglobate nel citoplasma mediante processi di fagocitosi, pinocitosi o micropinocitosi. L'identificazione di materiale incluso è importantissima per stabilire l'origine delle cellule. Inclu­sioni voluminose, che spostano il nucleo alla base della cellula, depongono per l'origi­ne ghiandolare della cellula stessa.

Per stabilire la provenienza esogena ed endogena di un incluso ci si avvale di tecniche citochimiche, m quanto le comuni metodiche citomorfologiche sono insufficienti per la caratterizzazione di queste sostanze. g)    Annessi cellulari

Si tratta di prodotti di adattamento che indicano funzioni altamente specializzate del­la cellula (tonofibrille, ciglia, etc). Nell'ambito dell'epitelio squamoso pluristratificato mucoso (vagina) un interessante prodotto di adattamento funzionale è rappresen­tato dall'apparato fibrillare.

 h)    Nucleo

Occorre considerare le seguenti caratteristiche:

- le dimensioni - ricavabili dal confronto con superfici note (l'area del nucleo delle cel­lule intermedie dell'epitelio Malpighiano è di 35-40 micron).

- l'area relativa - è la percentuale di area cellulare occupata dal nucleo.

- la forma - è sferica nelle cellule poligonali, rotonde e cubiche, dette anche cellule isodiametriche; è ovalare, irregolare o ellissoidale nelle cellule ovali, prismatiche ed al­lungate, dette anche cellule anisodiametriche.

- il numero - può essere unico (epitelio squamoso) o multiplo (fegato).

- la posizione - è centrale nelle cellule isodiametriche, e lo spostamento verso la base della cellula indica l'appartenenza ad elementi altamente differenziati (epitelio ghian­dolare).

-pattern cromatinico - nell'interfase si osserva la presenza del c.d. materiale cromosomico eterocromatinico, rappresentato da cromatina finemente granulare. I quadri del pattern sono: finemente granulare, opaco o translucido, finemente granulare con ad­densamenti o formazione di cromocentri, normalmente granulare. Atkin afferma che la presenza di cromatina granulare uniformente grossolana può rappresentare cellule in stadio mitotico iniziale. Nucleolo

Riflette l'attività metabolica della cellula al momento del prelievo. Quando il nucleo è in interfase, il contorno del nucleolo è sempre regolare.

 

 Capitolo XII

PRELIEVO DI CELLULE DAI VARI APPARATI

Tutti gli apparecchi organici comunicanti con l'esterno, mediante cavità o canali, elimi­nano all'esterno cellule di desquamazione che possono essere prelevate ed esaminate a sco­po diagnostico.

Pertanto, forniremo al cune informazioni in merito ad alcuni tipi di cellule di desquama­zione che hanno importanza nella pratica clinica:

-Esame dello striscio vaginale

-Esame delle cellule del canale cervicale e dell'endometrio

-Citologia dell'apparato genitale femminile

-Citologia dell'apparato urinifero

-Esame degli elementi cellulari presenti nell'urina

-Citologia della prostata

-Esame del materiale bronco-polmonare

-Citologia dell'apparato respiratorio

-Elementi cellulari presenti nell'espettorato

-Citologia dell'apparato digerente

-Citologia delle cavità sierose

-Citologia della mammella

-Citologia per aspirazione

-Tecniche citologiche

 

ESAME DELLO STRISCIO VAGINALE

È essenziale che la paziente non abbia eseguito docce o irrigazioni vaginali da almeno 24-48 ore, e che non abbia assunto farmaci che potrebbero alterare la mucosa cervico-vaginale. L'operatore inoltre non deve eseguire manovre digitali esplorative prima del prelievo.

Gli strumenti necessari per l'esecuzione dello striscio sono: speculum, asticina di legno con un'estremità avvolta da cotone idrofilo.

La donna deve essere posta in posizione genu-cubitale, detta anche posizione ginecolo­gica o 'del taglio della pietra'. Quest'ultima dizione trae origine dal fatto che un tempo i vecchi Ostetrici ponevano le donne su di un tavolo di pietra sedute sul bordo del tavolo stesso, a livello cioè del taglio della lastra di pietra.

Con lo speculum si evidenzia la portio uterina, si striscia il bastoncino sulla superficie esterna della portio e successivamente si introduce l'asticina di legno nel canale cervicale dove, con movimento rotatorio, si raccoglie il materiale secreto. Nel caso di secreto molto abbondante è conveniente eliminare con la bacchettina il muco che eventualmente si è rap­preso o coagulato.

Dopo il prelievo si estrae il bastoncino e, con movimento rotatorio, si spalma il materia­le su un vetrino portaoggetti (pulito), badando a non creare zone di accumulo che potreb­bero dar luogo ad artefatti e ad una falsa interpretazione del preparato.

A questo punto il vetrino contenente materiale strisciato deve essere fissato, e si può ri­correre a due metodiche differenti; a) immergere il vetrino in un contenitore pieno di fissa­tivo, o, meglio, b) spruzzarlo con fissativo spray (Merck), tenendo la bomboletta a 10 cm di distanza dal preparato. Questo ultimo metodo è senz'altro migliore perché oltre ad esse­re di rapida esecuzione distribuisce in maniera più uniforme il fissativo sulla superficie del vetrino e non asporta il materiale strisciato. Questo semplice metodo di prelievo consente la visione di cellule vaginali, esocervicali, ed endocervicali, che eventualmente sono entrate in vagina col muco. Ovviamente, pur se molto conveniente da un punto di vista pratico, questo sistema non è applicabile da solo nella citodiagnostica patologica, poiché non fornisce dati precisi circa la localizzazione di eventuali lesioni tumorali o simili.

Questo metodo può essere applicato quindi per avere informazioni sulla componente esfoliativa della vagina, della portio e dell'endocervice; i prelievi possono essere eseguiti separatamente per la vagina, per la portio e per l'endocervice o per tutte le tre componenti Triple smear method degli A.A. anglosassoni). Il grosso limite di questo metodo però è dato dal fatto che troviamo solo cellule già morte che potrebbero mostrare segni di soffe­renza dovuta ad autolisi, e che quindi fornirebbero falsi risultati diagnostici. Una valida alternativa a questo metodo, specie se si vuole esaminare la regione della giunzione squamoso-colonnare, è lo 'scraping' cervicale secondo Ayre. Per eseguire questo metodo si procede nella maniera seguente. Con lo speculum si visualizza la portio uterina, si introduce quindi la spatola di Ayre e si gratta la mucosa (scraping = grattamento) con un movimento rotatorio completo a livello della giunzione. Questo sistema però presuppone l'intervento di personale altamente qua­lificato, ed inoltre non si presta ad un esame completo della citologia vaginale, in quanto il materiale prelevato è limitato dalla zona della giunzione squamoso-colonnare.

ESAME DELLE CELLULE DEL CANALE CERVICALE E DELL'ENDOMETRIO

Questo particolare tipo di indagine ci permette di ottenere materiale proveniente esclusi­vamente dall'endocervice o dall'endometrio.

Oltre allo speculum, è necessario disporre di un catetere K 72 di Baxter o di una cannula di aspirazione di Jordan. Si introduce la cannula nell'utero, e quando l'estremità della stessa è nel canale endocervicale (o nel corpo dell'utero) si aspira con la siringa, si toglie lo strumento e si spruzza il materiale su di un vetrino portaoggetti.

Per l'endometrio si può eseguire una variante: invece di spruzzare il materiale sul por­taoggetti, lo si pone in una bottiglia contenente alcool etilico a 50°, si centrifuga e si inclu­de in paraffina il sedimento.

Questa metodica però è un ibrido, non è né istologica né citologia; non è istologia per­ché il preparato non consente la visione d'insieme dell'architettura tissutale, non è citolo­gia perché non è possibile esaminare singole cellule.

CITOLOGIA DELL'APPARATO GENITALE FEMMINILE

L'apparato genitale femminile è composto da: vulva, vagina, utero, tube, ovaie.

La vulva fa parte dei genitali esterni, e le ovaie comprendono anche una porzione endocrina.

Circa la situazione ed i rapporti di questi organi nella cavità pelvica, si rimanda ai tratta­ti di Anatomia macroscopica. Nella vagina e nell'utero sono reperibili, all'esame istologi­co; tre tipi di epitelio: l'epitelio pluristratificato non corneificante (o squamoso o Malpighiano) della vagina e dell'utero (pars vaginalis della cervice); l'epitelio del canale cervica­le (compreso fra gli orifici uterini interno ed esterno); l'epitelio del corpo dell'utero, o en­dometrio.

Struttura della Mucosa, Vulvare, Vaginale ed Esocervicale

L'epitelio squamoso presenta a considerare diversi strati di cellule. Lo strato germinati­vo o basale, lo strato intermedio e lo strato superficiale. Alcuni A.A. separano lo strato germinativo da quello basale (Graham), considerando così quattro strati, ed altri A.A. in­vece di strato intermedio parlano dì strati spinosi superficiale e profondo e di strato cor­neo invece che di strato superficiale. È preferibile la divisione istologica in tre strati e quel­la citologica in quattro strati, perché la ulteriore suddivisione dello strato basale in due tipi di cellule (basali e parabasali) può essere fatta solo citologicamente e non istologicamente. Le cellule parabasali, infatti, provengono dalla zona di confine fra strato basale ed inter­medio, ed alcuni A.A. parlano di più strati a livello basale, mentre altri fanno originare le cellule parabasali da questo strato nella sua porzione più esterna (Gompel).

Questo tipo di mucosa reagisce agli stimoli ormonali, ed il grado della risposta dipendedalla quantità e dal tipo di ormoni, nonché dal numero di recettori per quell'ormone e dal­la stabilità del complesso ormone - recettore. Si tratta in sostanza di una struttura dinami­ca che presenta, in età fertile, aspetti diversi a seconda dell'entità dei vari ormoni circolan­ti. Oltretutto i vari tipi cellulari hanno un ciclo vitale relativamente corto con tempo di rimpiazzamento intorno ai 7-10 gg. Le basi per lo studio del turnover cellulare, nella mo­derna citodiagnosi, sono state date da studi effettuati da Papanicolau mediante sommini­strazioni di estrogeni nei roditori.

Gli estrogeni provocano un ispessimento di tutto l'epitelio, ma in special modo dello strato superficiale, le cui cellule appaiono più eosinofile per aumentata sintesi proteica, e la cromatina nucleare appare molto addensata.

Il progesterone, invece, stimola maggiormente lo sviluppo dello strato intermedio, le cui cellule appaiono ricche di glicogeno.

Anche gli ormoni androgeni provocano la crescita dello strato intermedio, ma l'effetto di questi steroidi è diverso da quello dei progestinici per la minima quantità di glicogeno presente nelle cellule.

Gli strati cellulari dell'epitelio squamoso in età fertile, prevede la presenza dei seguenti tipi di cellule:

1) Strato basale, o delle cellule cilindriche;

2) strato parabasale, o spinoso profondo

3) strato intermedio, o spinoso superficiale

4) strato superficiale, o delle cellule cornee.

Fra la zona superficiale e quella intermedia si può a volte osservare un quinto strato: lo strato intraepiteliale o zona corneificata di Dierks.

Il significato di questa zona, che fra l'altro è omologa alla zona intraepiteliale dei rodi­tori, è stato variamente interpretato. Dierks lo ha denominato 'strato funzionale'in quan­to è in relazione con il ciclo mestruale, mentre Papanicolau lo ha definito 'strato epiteliale corneificato '.

Quando, in seguito ai parti, l'utero può andare incontro al cosidetto 'prolasso uterino', è possibile osservare a volte un epitelio di tipo cheratinizzato, che presenta i vari strati di­sposti nella seguente maniera:

1) Zona basale

2) zona parabasale

3) zona intermedia

4) zona della cellule granulari

5) zona superficiale di cheratina

Poiché il quarto strato può derivare dallo strato intraepitaliale, si può convenire con Dierks che questo rappresenti in effetti un momento funzionale legato alle variazioni or­monali che determinano il ciclo mestruale.

Nello striscio citologico vaginale troviamo i seguenti elementi cellulari appartenenti all'epitelio squamoso:

Cellule superficiali

In passato sono state spesso definite 'cellule corneificate' o 'cellule cariopicnotiche' e sono le cellule più grandi dello striscio vaginale; misurano 40-50 micron di diametro, men­tre il nucleo è di 5-6 micron. Caratteristica di queste cellule è la piccolezza del nucleo, che appare picnotico (= con cromatina addensata ed uniforme), e l'uniformità del citoplasma. che appare omogeneo ed intensamente eosinofilo (= rosa).

A volte può riscontrarsi la presenza di granulazioni scure, che dovrebbero essere lipidi prodotti dallo stimolo estrogenico.

A volte il citoplasma può assumere i coloranti basici, e ciò è dovuto alla presenza di pro­teine acide, che non sono altro che i precursori della cheratina.

In condizioni normali, infatti, queste cellule non contengono cheratina, ma solamente le proteine basofile (cioè acidi) che ne sono i precursori.

Durante l'esfoliazione, però, questi precursori si trasformano in cheratina, e da qui deriva l'intensa eosinofilia. Il grado maggiore o minore di eosinofilia è, quindi, un indicatore dello stadio di maturazione di queste cellule, come lo è il reperto di cellule singole o riunite in gruppi.

Se si repertano solo elementi singoli, significa che il ciclo maturativo è giunto al termine, mentre se sono evidenziabili gruppi di cellule superficiali non è ancora avvenuta la matura­zione. I desmosomi, infatti, si staccano solo alla fine del ciclo maturato. Le cellule superfi­ciali sono un elemento costante e prevalente nello striscio vaginale normale.

Cellule intermedie

Misurano circa 30-50 micron di diametro e l'area cellulare secondo alcuni è di 160 i 312 micron2, secondo altri di 155+-595 micron2. Il diametro nucleare è di circa 5-6 micron e l'area nucleare media di 13+-36 micron2. Hanno citoplasma cianofilo (azzurro) ed abbon­dante, con un nucleo più grande rispetto alle superficiali e di forma vescicolosa. Dato che le cellule intermedie sono molto sensibili alla stimolazione ormonale, durante la gravidan­za esse si arricchiscono di glicogeno ed assumono un aspetto definito 'navico/are', con un nucleo eccentrico.

Le cellule intermedie presentano inoltre un addensamento della regione periferica, do­vuto alla migrazione di organuli intracitoplasmatici a questo livello, ed un citoplasma più chiaro.

Il volume delle cellule intermedie diminuisce mano mano che ci si avvicina verso lo stra­to superficiale, e questa caratteristica le fa classificare in piccole e grandi cellule interme­die. La loro presenza nello striscio è strettamente legata alle fasi del ciclo mestruale, e sono numerose prima e dopo le mestruazioni, in gravidanza, e negli stati di ipoestrogenismo.

Cellule parabasali e basali

Hanno un diametro di 12-30 micron e forma ovalare o, quando desquamano in gruppi,

poligonale.

Il nucleo è grande con cromatina a granuli, ed il citoplasma è a limiti netti, intensamente cianofilo ed omogeneo. A volte però si possono riscontrare dei vacuoli intracitoplasmati­ci, dovuti a fenomeni di fagocitosi.

Le cellule basali sono più piccole e per il resto hanno le stesse caratteristiche delle parabasali; l'unica differenza sostanziale consiste nel fatto che nelle cellule basali la distanza fra membrana nucleare e membrana citoplasmatica è sempre inferiore al diametro del nu­cleo mentre ciò non avviene nelle cellule parabasali.

Le cellule parabasali sono osservabili nello striscio vaginale durante la menopausa, o prima della pubertà e negli stati di ipoestrogenismo di grado elevato. Le cellule basali sono presenti solo nei casi patologici (atrofia, erosione, etc).

A livello dell'orifizio uterino interno si ha il brusco passaggio dallo epitelio malpighiano della 'pars vaginalis' della cervice all'epitelio cilindrico del canale cervicale (o endocervice).

Questa zona di passaggio è definita 'giunzione squamoso-colonnare', che indica appun­to il passaggio tra epitelio squamoso ed epitelio cilindrico (o colonnare). Nella donna gio­vane questa giunzione avviene generalmente a livello dell'orifizio uterino esterno, mentre in donne che hanno già partorito, e in special modo le multipare, la giunzione può trovarsi a livello vaginale. Questo fatto dipende dal prolasso della mucosa conseguente ai ripetuti parti.

Nella donna anziana, durante la menopausa, si può avere al contrario una retrazione in­trauterina di questa giunzione, dovuta all'atrofia della mucosa.

La letteratura classica affermava che la transizione dei due epiteli avvenisse in maniera brusca, ma è stato osservato che ciò è valido solo per il 37% dei casi. Per il restante 63% il passaggio è graduale, ed occupa la superficie maggiore. Indagini colposcopiche hanno confermato queste affermazioni. I colposcopisti, inoltre, hanno individuato una regione definita "zona di trasformazione', in cui è localizzata la giunzione nel 95% dei casi. Questa regione è molto importante nei processi di carcinogenesi. Studi approfonditi sulla cito-istologia della cervice sono stati fatti da Coppleson, Reid, e Llagley e Crompton.

L'epitelio di rivestimento della cervice è, come abbiamo detto, del tipo cilindrico alto, con nuclei ovalari disposti lungo l'asse maggiore delle cellule in posizione basale. Il cito­plasma appare vacuolizzato per la presenza di mucopolisaccaridi acidi (MPSA), evidenzia-bili con l'Alcian Blu. A volte è reperibile la presenza di ciglia.

Le ghiandole cervicali sono del tipo tubulare ramificato, e gli elementi di rivestimento sono identici a quelli dell'epitelio.

L'endometrio è composto da cellule cubiche, con nuclei in posizione intermedia; questo carattere è distintivo, in istologia, rispetto alle cellule cervicali.

Le ghiandole cervicali sono del tipo tubulari semplici, e durante l'età fertile vanno in­contro a modificazioni periodiche durante il ciclo mestruale. A seconda dello stimolo or­monale la struttura cellulare può subire profonde alterazioni; nella fase iniziale del ciclo, sotto l'influenza degli estrogeni, l'epitelio di rivestimento si trova in fase proliferativa, mentre sotto l'influenza dei progestinici l'epitelio di rivestimento passa in fase secretoria. Durante la fase proliferativa queste cellule si arricchiscono di glicogeno. Il glicogeno verrà poi escreto nella fase secretiva.

Nello striscio vaginale normale le cellule cervicali sono assenti, mentre si repertano negli aspirati e negli scrapings cervicali.

Queste cellule appaiono spesso raggruppate a 'nido d'ape' e presentano contorni cito­plasmatici poco netti e, data la loro attività mucosecernente, contengono vacuoli di secre­to. Il nucleo contiene cromatina a zolle, finemente granulare. La loro lunghezza varia dai 25 ai 30 micron, ed il nucleo misura circa 7 micron di diametro lungo l'asse maggiore.

Le variazioni del pH verso l'acidità durante il tragitto verso la vagina provocano altera­zioni in queste cellule, che possono presentare: scomparsa delle ciglia, picnosi nucleari, va­cuolizzazione del citoplasma.

Le cellule endometriali non compaiono mai nello striscio vaginale in condizioni norma­li, mentre possono essere presenti in stati patologici (tumori).

Esse però possono essere messe in evidenza tramite aspirazione endometriale ma quest'ultima metodica è diversa dallo striscio vaginale.

 ESAME DEGLI ELEMENTI CELLULARI PRESENTI NELL'URINA

La presenza più o meno, numerosa di elementi cellulari nell'urina varia a seconda se si tratta di materiale emesso spontaneamente o di materiale prelevato mediante cateterismo.

L'urina emessa spontaneamente è molto povera di cellule, e si possono reperire sola­mente tipi cellulari ovali, che hanno una vaga rassomiglianza con le cellule parabasali del­lo striscio vaginale. Queste cellule sono generalmente degenerate, in quanto l'urina è un mezzo ipertonico. La provenienza è generalmente uretrale nel maschio, mentre per la fem­mina bisogna considerare l'eventualità di una possibile contaminazione da parte di cellule sfaldate dell'epitelio squamoso della vagina. In condizioni normali, tranne pochissimi eritrociti, non sono presenti altri elementi cellulari, i quali, quando sono reperibili, depon­gono per un processo patologico in atto.

Il cateterismo delle vie urinifere rivela tipi cellulari diversi, a seconda del segmento esa­minato. L'urina di provenienza vescicale contiene in genere delle cellule ovalari, con un caratteristico prolungamento citoplasmatico che le fa assomigliare vagamente ad un girino (attenzione a non confondere queste cellule con quelle a girino dei tumori delle vie genitali femminili!) e che probabilmente rappresenta il mezzo di fissità di queste cellule con la membrana basale dell'epitelio. Appaiono a grappoli, e la loro presenza è causata per lo più dall'azione del catetere sulla vescica.

L'urina uretrale o della pelvi renale contiene numerosi elementi cellulari, rappresentati per la maggior parte da grosse cellule multinucleate con nuclei rigonfi e degenerati, tali da far pensare addirittura alle lesioni provocate dalle radiazioni. A volte si riscontrano altri tipi di cellule, quali elementi poliedrici con prolungamenti citoplasmatici, cellule fusifor­mi, e, a volte, cellule dalla forma bizzarra. Bisogna tener presente che l'indagine sul mate­riale è eseguita su cellule morte, e che sono quindi possibili alterazioni biochimiche dei componenti nucleari e citoplasmatici (es: vacuolizzazione).

L'indagine sull'epitelio delle vie urinifere, anche mediante cateterismo, è abbastanza agevole, in quanto si tratta di un solo tipo di epitelio. Le uniche difficoltà sono da attri­buirsi ad un uso sconsiderato del catetere, che può provocare traumi alla parete degli orga­ni, o ad una difettosa sterilizzazione del medesimo, che può infettare l'urina contenuta nelle vie urinifere, che in condizioni normali è sterile.

CITOLOGIA DELLA PROSTATA

L'indagine citologìca della prostata offre non poche difficoltà, in quanto innanzitutto non esiste un'esfoliazione reperibile spontaneamente, ed inoltre la presenza di svariati tipi di epitelio rende difficoltoso il riconoscimento delle cellule prostatiche. L'induzione, in questo caso, si effettua mediante massaggio prostatico per via rettale.

Le cellule prostatiche sono cilindriche, con nuclei piccoli e rotondi e citoplasma che può essere chiaro o granulare. È molto importante sapere che queste cellule reagiscono positi­vamente alle colorazioni per la fosfatasi acida, e questo metodo è quindi determinante per una diagnosi differenziale con altri tipi cellulari.

I possibili contaminanti sono rappresentati dalle cellule delle vescichette seminali, dai corpi amilacei, dagli spermatozoi e da cellule uretrali, nonché da macrofagi. Le cellule del­le vescichette seminali sono facilmente riconoscibili poiché contengono nel citoplasma dei caratteristici granuli di pigmento giallo; i corpi amilacei, rarissimi, sono simili a quelli che si riscontrano a livello dell'apparato respiratorio, e sono costituiti da addensamenti con-centrici di cheratina. Gli spermatozoi espulsi dalle vescichette seminali possono comparire a volte in seguito a massaggio prostatico, e spesso si possono reperire anche precursori di questi elementi (spermatidi); i macrofagi, vengono osservati mentre fagocitano gli sperma­tozoi, e si presentano completamente ricoperti da questi.

ESAME DEL MATERIALE BRONCO-POLMONARE

II materiale proveniente dall'apparato respiratorio può essere emesso sia spontanea­mente che mediante mezzi di induzione. L'espettorato emesso spontaneamente con colpi di tosse deve essere versato in un recipiente a bocca larga, contente liquido fissativo (alcool 50°-70°); dopo centrifugazione si processa come per i preparati dell'apparato genitale femminile.

Nel caso di assenza del materiale emesso spontaneamente (sia per assenza del riflesso della tosse che per scarsezza di secreto) si può provocarne l'emissione con il metodo dell'aerosol.

Si riempie con una soluzione salina ipertonica di glicol propilenico (NaCl 150 gr, glicol propilenico 200 ml, portare a 1000 cc con acqua distillata) un nebulizzatore, e si fa inalare l'aerosol al soggetto; si fa espettorare in una bottiglia a bocca larga e si prosegue come al solito. Nel caso di mancata emissione immediata, il materiale viene emesso dopo qualche ora.

Come per gli strisci vaginali, il materiale proveniente dall'espettorato fornisce una visio­ne d'insieme della citologia bronco-polmonare, ma, ad occhio poco esperto, l'enorme nu­mero di elementi cellulari crea non poche confusioni. Migliori risultati si ottengono con l'aspirazione e con il lavaggio bronchiale. Per eseguire questo metodo il soggetto in esame è disteso in posizione supina, si introduce il broncoscopie fino al segmento polmonare de­siderato, quindi si instilla soluzione fisiologica a 2-3 ml per volta fino ad un massimo di 10 ml, in modo da ottenere un liquido di lavaggio che verrà poi aspirato con il broncoscopie. Il materiale raccolto dovrà essere messo in un recipiente e fissato.

CITOLOGIA DELL'APPARATO RESPIRATORIO

Le vie aerifere vanno dalla cavità orale alle più fini diramazioni bronchiali (alveoli pol­monari); esse sono formate da: cavità orale, faringe, laringe, trachea, bronchi e polmoni.

Il primo tratto, comprende la cavità orale ed il faringe ed è comune con l'apparato dige­rente. Nel tratto respiratorio esistono due tipi di epitelio: l'epitelio squamoso e la mucosa respiratoria.

L'epitelio squamoso (pavimentoso non cheratìnizzato) o di tipo buccale, riveste la cavi­tà orale, parte del faringe (oro - ed ipofaringe), la porzione superiore della laringe, le ton­sille e le corde vocali.

L'epitelio respiratorio (prismatico pseudostratificato) ricopre le cavità nasali, i seni paranasali, l'epifaringe, la trachea e l'albero bronchiale.

L'epitelio della cavità orale, essendo costantemente bagnato dalla saliva, presenta rari fenomeni di disidratazione cellulare. Le cellule esfoliate appartengono per lo più agli strati superficiali e sono morfologicametne identiche a quelle dell'epitelio genitale femminile, in quanto possono essere agevolmente comparate alle cellule superficiali ed intermedie dellostriscio vaginale.

Occasionalmente possono comparire cellule più piccole, simile alle parabasali o addirit­tura simili alle cellule basali provenienti dagli strati più profondi. Questo reperto è da met­tere in relazione ad erosione od ulcerazione della parete. Il riscontro di queste cellule può creare a volte delle difficoltà per la diagnosi differenziale con cellule patologiche.

Occasionalmente possono essere osservate delle 'perle cornee' benigne ed alcune piccole cellule squamose fusate.

Prendono il nome di perle cornee quegli ammassi di materiale desquamato che si accu­mulano in strati concentrici. Pare siano dovuti ad un'inversione della crescita degli epiteli Malpighiani, con il risultato di una deposizione intracoriale di sostanze cornea.

Le cellule dell'epitelio buccale costituiscono spesso la sola componente citologica dell'espettorato, ma tale reperto non è considerato idoneo per una diagnosi citologica bronco-polmonare.

CELLULE DELL' EPITELIO RESPIRATORIO

L'epitelio respiratorio è composto da tre tipi di cellule: le cellule ciliate, le cellule caliciformi e le cellule dello strato germinativo (o basali o di riserva).

Cellule ciliate - di forma cilindrica, sono facilmente riconoscibili per la presenza di ciglia al polo apicale; il nucleo, rotondo od ovale, è in genere situato in posizione basale, anche se non è raro il reperto di un nucleo in posizione intermedia. L'estremità provvista di ciglia è fornita di un or letto a spazzola che fa da supporto alle ciglia. L'altra estremità della cellula è più assottigliata e termina a forma di frusta. Il citoplasma è omogeneo e basofilo.

Le cellule ciliate desquamano spesso in piccoli gruppi o ammassi, specialmente dopo broncoscopia. L'assenza di ciglia in queste cellule è segno di sicura degenerazione.

Cellule caliciformi - Sono elementi mucosecernenti interposti fra le cellule ciliate. De­squamano spesso in ammassi, dando a volte perfino un aspetto a nido d'ape, e sono facil­mente riconoscibili per la forma globosa del corpo cellulare, per il nucleo in posizione ba­sale ed il citoplasma debolmente basofilo e vacuolizzato (presenza di abbondante secrezio­ne). Le cellule caliciformi sono rare nel materiale bronchiale, e la loro presenza in quantità cospicua è indice di bronchite cronica, asma o bronchiectasie.

Per bronchiectasia si intende la dilatazione patologica del calibro di un bronco che può causare infezioni secon­darie dovute a ristagnio di muco.

Cellule germinative - sono elementi piccoli, poligonali e con scarso citoplasma; sono as­senti nella secrezione bronchiale normale, e la loro presenza è dovuta a traumi (broncosco­pia), infiammazioni o irritazioni croniche (grandi fumatori).

Data la loro somiglianza con le cellule basali dell'epitelio pavimentoso buccale, bisogna fare molta attenzione a non confonderle con queste o con cellule di una metaplasia epidermoide o addirittura con cellule tumorali.

Un attento esame della morfologia di queste cellule, e soprattutto il riscontro di elemen­ti ciliati o caliciformi ben differenziati, evita tale grave errore diagnostico.

Ovviamente nel materiale citologico non si repertano le cellule dell'epitelio alveolare.

Gli alveoli polmonari sono ricoperti da un solo strato di cellule epiteliali fornite di lun­ghi prolungamenti citoplasmatici, e che sono rivestite da una sostanza tensioattiva deno­minata surfactant, che viene prodotta dalle cellule alveolari dei setti e che ha il compito di evitare il collabimento degli alveoli.

La funzione di tutti questi elementi cellulari è da inquadrare ovviamente in quella dell'apparato respiratorio.

L'aria inspirata contiene quantità variabili di contaminanti ambientali, e queste sostan­ze estranee non debbono spingersi fino agli alveoli, che, normalmente, debbono rimanere sterili. Le cellule mucosecernenti, umettando continuamente la mucosa respiratoria, crea­no le condizioni necessarie all'adesione delle particelle estranee, e le cellule ciliate, tramite movimenti retrogradi delle ciglia, respingono questo materiale all'esterno.

Può capitare che alcune particelle (sangue, polvere, etc) superino la barriera e raggiun­gano gli alveoli, che fra l'altro sono sprovvisti di organi capaci di allontanare materiale estraneo. A questo punto intervengono cellule particolari, che normalmente sono a ripo­so. Queste cellule, situate nel connettivo interstiziale interalveolare, provvedono alla fago­citosi del materiale estraneo, e sono denominate istiociti o cellule settali o cellule della pol­vere.

Oltre agli elementi propri agli epiteli di rivestimento, nello striscio citologico bronco­polmonare sono presenti altri elementi cellulari: i macrofagi polmonari ed i leucociti.

Macrofagi polmonari

Queste cellule sono molto importanti per l'interpretazione del materiale citologico, in quanto sono indice della provenienza del materiale dal tratto respiratorio profondo.

Di forma rotonda od ovale, queste cellule hanno limiti netti, ed un citoplasma che può essere acidofilo, basofilo o anfofilo.

I nuclei, spesso multipli, possono variare di numero, ma spesso sono piccoli e periferici. Queste cellule sono una variante istiocitaria, e come tali hanno proprietà granulopessica.

II citoplasma dei macrofagi è spesso infarcito di elementi estranei, quali granuli di pol­vere etc. Cellule istiocitarie giganti, con nuclei doppi o tripli, possono essere confuse con le cellule tumorali.

I leucociti sono frequenti nell'espettorato. La presenza di leucociti eosinofili è indice di un processo allergico in atto; il reperto di leucociti disfatti (che costituiscono il pus) indica la presenza di germi piogeni a causa di un processo infiammatorio acuto.

MATERIALE NON CELLULARE

In un esame citologico polmonare, sia esso proveniente da espettorato o da lavaggio bronchiale, possiamo reperire diversi componenti inorganici; essi sono:

spirali di Curshtnann - frequenti nelle malattie croniche del polmone (asma), sono costituite da muco , e ripetono la forma di piccoli bronchi. La forma a spirale, l'asse centrale vociato all'aspetto opalescente delle pareti periferiche, ne permettono facilmente l' individuazione.

Corpi amilacei - formazioni eosinofile tondeggianti e lucenti formate da proteine con ­reperibili occasionalmente nell'espettorato.

Muco ispessito sotto forma di globi scuri, e concrezioni calcifiche possono essere reperite nello striscio. Le prime possono simulare nuclei di cellule anormali, ma l'assenza di una struttura nucleare evita ogni dubbio, e le seconde sono molto frequenti in individui a tubercolosi di vecchia data.

ELEMENTI DI CONTAMINAZIONE

Materiale proveniente da vegetali può spesso contaminare il materiale citologico polmonare. Grandi  particelle cellulari, con la loro caratteristica membrana di cellulosa, sono di facile riconoscimento. Cellule isolate, senza membrana di cellulosa, possono essere confuse

quelle maligne per i loro grossi nuclei. Però la presenza di granuli rifrangenti nel citoplasma e la mancanza di una vera struttura nucleare nelle cellule vegetali sono di aiuto nella corretta interpretazione.

ELEMENTI CELLULARI PRESENTI NELL 'ESPETTORA TO

L'espettorato si differenzia dalla saliva, che non ha valore diagnostico, perché quest'ulti­ma contiene solo cellule squamose.

Un buon campione di espettorato deve contenere molti macrofagi alveolari. Cellule ciliate e caliciformi si trovano in numero scarso nel materiale emesso spontaneamente. Nel materiale prelevato con la broncoscopia o con altri procedimenti che traumatizzano la mucosa bronchiale, queste cellule sono più abbondanti.

ELEMENTI CELLULARI CHE SI TROVANO NELL'ASPIRATO E NEL LAVAGGIO BRONCHIALE.

 I costituenti principali di un buon lavaggio bronchiale sono le cellule ciliate dell'epitelio

respiratorio.

Queste cellule possono trovarsi isolate o in gruppi o lembi, ed occasionalmente mostra­no alterazioni dovute al trauma del prelievo. Le cellule predominanti nell'espettorato sono presenti in piccola quantità nel liquido di lavaggio bronchiale. Cellule caliciformi, rare nell'espettorato, possono essere presenti in numero maggiore sia nell'aspirato che nel la­vaggio bronchiale.

CITOLOGIA DELL'APPARATO DIGERENTE

L'esame citologico dell'esofago si esegue mediante lavaggio, durante l'endoscopia.

Si iniettano piccole quantità di soluzione fisiologica (fino ad un massimo di 10-20 cc) e si aspira con la siringa; il materiale va quindi posto in un recipiente contenente liquido fissa­tivo (alcool 50° - 70°).

È ovvio, negli esami endoscopici, che il paziente venga precendentemente sottoposto ad anestesia locale, ottenibile mediante tavolette di Tetracaina (da succhiare) ed iniezione en­dovenosa di benzodiazepine e Reserpina.

Istologicamente il rivestimento della mucosa esofagea è formato da un epitelio piatto pluristraficato (o squamoso) non corneificato, che si estende per tutte e tre le porzioni dell'esofago e termina bruscamente a livello del cardias, per continuarsi con l'epitelio cu­bico dello stomaco.

Citologicamente non esiste un'esfoliazione spontanea che si può raccogliere su vetrino, per cui i prelievi vanno fatti con esame endoscopico per mezzo di lavaggio ed aspirazione.

L'elemento predominante risulta essere la cellula superficiale, anche se possono essere reperite nello striscio elementi più piccoli, del tipo intermedio e parabasale. Non è raro il riscontro di cellule ciliate dell'epitelio respiratorio, che possono pervenire nell'esofago in seguito a rigurgito di materiale espettorato. In caso di ectopie gastriche ( = presenza di iso­le di mucosa appartenente allo stomaco nella regione cardiale dell'esofago) è facile rinve­nire anche cellule cubiche. Di provenienza respiratoria sono anche i macrofagi della polve­re eventualmente presenti.

Materiali contaminanti molto comuni sono le fibre vegetali ed i residui alimentari, spe­cie se sussiste un ostacolo al normale transito verso lo stomaco.

L'esame citologico dello stomaco si esegue con soggetto digiuno, che deve bere acqua per 8 ore in modo da pulire lo stomaco dal muco. Si usa il tubo di Levin come endoscopie, facendo attenzione a lubrificarlo solo con glicerina. A questo punto si somministrano, po­co per volta, 500 cc di soluzione di Ringer, sciacquando la cavità gastrica con continui la­vaggi, e facendo compiere rotazioni al soggetto in modo da favorire il risciaquo. Dopo cir­ca 10' (o anche meno) si estrae il liquido, si fissa, si centrifuga e si stiscia su vetrino.

Come per tutti gli organi dell'apparato digerente, il materiale ottenuto mediante lavag­gio è molto scarso in condizioni normali, e quindi bisogna inquadrare subito nel vasto campo della patologia ogni esame citologico gastro-intestinale che mostri abbondanza di elementi cellulari.

L'epitelio gastrico è composto da cellule cubiche mucosecernenti, e l'intera mucosa è tappezzata da ghiandole tubulari semplici, formate da diversi tipi di cellule: le cellule pa­rietali, le cellule principali, le cellule del colletto e le cellule enterocromaffini.

Le cellule esfoliate sono del tipo mucosecernente, ed appartengono quindi all'epitelio di rivestimento della parete e non delle ghiandole. Esse si presentano in ammassi o grappoli che, nella regione centrale, assumono il caratteristico aspetto a nido d'ape, mentre perife­ricamente mostrano il classico aspetto dell'epitelio di rivestimento gastrico. Pur trattando­si di cellule mucosecernenti, il loro nucleo è disposto piuttosto centralmente, a differenza delle cellule caliciformi e di quelle cosidette 'ad anello'. La loro presenza è da inquadrare nelle abrasioni che l'endoscopio può produrre a livello della mucosa, con conseguente di­struzione di alcune cellule.

Le cellule piloriche sono riconoscibili per la presenza di vacuoli intracitoplasmatici con-tenenti muco, e per la posizione del nucleo in sede periferica e non centrale.

Gli elementi contaminanti, oltre che quelli in comune con l'esofago, sono rappresentati da altri tipi cellulari, ad esempio i polimorfonucleati ed i linfociti, e dalla presenza occa­sionale della Giardia Lamblia, un parassita dell'apparato gastroenterico.

Duodeno

II metodo per effettuare il prelievo è lo stesso che per lo stomaco; può essere necessaria a volte anestesia totale.

Colori

Per il grosso intestino si procede inizialmente con un clistere evacuativo, allo scopo di li­berarlo da eventuali residui alimentari e fecali. Ottimi lassativi sono l'olio di ricino e l'olio di vasellina, che debbono essere somministrati almeno 12 ore prima della raccolta del ma­teriale citologico. A questo punto si somministrano dai 500 ai 1000 cc di soluzione Ringer, e si massaggia l'intestino, facendo compiere anche dei movimenti rotatori al soggetto in esame. Dopo qualche tempo (3-5') il materiale fuoriesce spontaneamente per via anale, e può essere raccolto ed esaminato.

L'epitelio di rivestimento della mucosa del grosso intestino è formato da cellule cilindriche simili agli enterociti dell'intestino tenue, con interposte cellule caliciformi e presenza di numerose ghiandole i cui lumi sboccano a livello delle pieghe della mucosa.

A livello del retto, però, c'è una variazione dell'epitelio di rivestimento che, specialmen­te nella zona intermedia, assume la struttura di un epitelio Malpighiano. Il retto infatti (come l'esofago) non ha funzione assorbente, ma serve solo come zona di transito per le scorie del materiale alimentare digerito.

Citologicamente, quindi, avremo un quadro abbastanza semplice, composto da elemen­ti cilindrici, cellule caliciformi, macrofagi, leucociti e cellule di origine squamosa prove­niente dal canale anale.

Non esiste una casistica citologica per quanto riguarda l'intestino tenue in quanto que­sta porzione dell'apparato digerente non è raggiungibile dalle comuni sonde impiegate per questi prelievi. Un intervento anterogrado (dalla cavità orale) troverebbe molte difficoltà sia per la lunghezza dei segmenti da attraversare (esofago, stomaco, duodeno), che per gli ostacoli che si incontrerebbero durante il cammino della sonda (cardias, piloro); un tenta­tivo retrogrado (dal retto) poi è assolutamente impossibile, perché c'è l'ostacolo insor­montabile rappresentato dalla valvola ileo-ciecale del Bahuin, che, come è noto, è pervia solo in senso anterogrado. Per questo motivo la valvola di Bahuin era un tempo denomi­nata «la barriera degli speziali», in quanto le sonde introdotte dagli Speziali (cioè i medici di allora) per via rettale non riuscivano a superarla.

CITOLOGIA DELLE CA VITA SIEROSE

Le sierose dell'organismo (pleure, pericardio, peritoneo) sono composte da due sottili foglietti, parietale e viscerale, che derivano dalla riflessione della stessa membrana. Questi foglietti, quindi, non sono in comunicazione con l'esterno, e contengono nel loro interno una esilissima quantità di liquido che ne favorisce lo scorrimento.

Embriologicamente derivano dal rivestimento della primitiva cavità celomatica, e quindi gli elementi che le compongono sono cellule mesoteliali. Lo spazio compreso tra fogliet­to parietale e viscerale è, in condizioni normali, uno spazio virtuale, ma, in condizioni patologiche per l'aumento del liquido intrasieroso diventa uno spazio reale.

Bisogna tener presente che normalmente non esiste un'esfoliazione citologica a livello delle sierose, per cui, pur non essendo nostro compito esaminare le condizioni che provo­cano un aumento del contenuto liquido nelle cavità sierose, faremo un accenno solo alla composizione del trasudato.

In patologia un accumulo abnorme di liquido in una cavità sierosa prende il nome di «versamento», che può essere distinto in trasudato ed essudato. La differenza tra questi due tipi di versamenti sta nel diverso contenuto proteico, che è insignificante nel trasudato e cospicuo nell'essudato.

Nei trasudati sono reperibili anche cellule mesoteliali, ed a volte scarsissimi leucociti ed istiociti. Un aumento delle componenti cellulari depone per la diagnosi di essudato.

Il prelievo del materiale, per l'esecuzione di queste indagini consiste in un aspirazione mediante siringa, munita di apposito ago.

CITOLOGIA DELLA MAMMELLA

Anatomicamente la mammella è composta da una ventina di ghiandole, circondate da tessuto adiposo. Il tessuto di sostegno è ricco di cellule adipose, e le diramazioni dei dotti ricordano quelle dell'albero bronchiale (sono cioè dicotomiche), diminuendo di volume dai dotti principali (situati nel capezzolo) a quelli periferici, e approfondendosi nello stroma della ghiandola. I dotti periferici si sfioccano nei lobuli, che rappresentano la parte secernente della mammella.

Come è noto la mammella subisce l'effetto degli ormoni ipofisari e sessuali, ed inoltre presenta a considerare un notevole grado di ipertrofia durante l'allattamento. Non è no­stro compito esaminare le modificazioni morfo-funzionali della mammella durante l'allat­tamento, e ci limiteremo quindi a descrivere la citologia normale della ghiandola mamma­ria in condizioni standard.

Cellule epiteliali - sono gli elementi di rivestimento dei dotti galattofori, ed hanno forma cilindrica o cubica, con nucleo disposto in posizione periferica.

Cellule idrosadenoidi - di forma ovalare, hanno un citoplasma eosinofilo con nucleo ec­centrico. Queste cellule ricordano quelle delle ghiandole sudoripare, infatti i dotti ed i lo­buli galattofori non sono altro che ghiandole sudoripare apocrine modificate.

Nel secreto mammario si trovano inoltre cellule schiumose (a citoplasma vacuolizzato), cellule della lattazione ed elementi mioepiteliali. Queste ultime sono in genere indice di iperplasia ( = aumento di numero degli elementi in una componente tissutale).

Le tecniche di prelievo del materiale della mammella si attuano mediante aspirazione di­retta.

CITOLOGIA PER ASPIRAZIONE

Questa metodica diagnostica può essere usata teoricamente per tutti gli organi del corpo umano, anche se all'atto pratico trova qualche limitazione nella sua attuazione. Il grosso vantaggio di questo metodo è la possibilità di eseguire indagini microscopiche «a cielo co­perto», cioè senza intervento chirurgico. Attraverso la puntura, infatti, si riescono a raggiungere organi che una volta necessitavano di intervento chirurgico anche per scopi pura­mente esplorativi.

STRUMENTI

Vengono usati un ago e una siringa speciale. Gli aghi variano in diametro e lunghezza a seconda dell'organo da esaminare. Per eseguire la biopsia di organi raggiungibili per via rettale o transvaginale ci si avvale di uno strumento molto semplice, ideato da Franzén, che consiste in un semianello di metallo che l'operatore applica al dito esploratore. L'anel­lo ha una scanalatura a mò di imbuto in modo da permettere la penetrazione dell'ago, che viene guidato dal dito fino al punto prescelto.

Dal punto di vista tecnico abbiamo due tipi di aspirazione:

Transcutanee, che si dividono a loro volta in:

- aspirazione di regioni palpabili (aspirazione di tipo semplice)

- aspirazione di regioni non palpabili (aspirazione di tipo profondo).

Transrettali e transvaginali.

Per le prime non è necessaria nemmeno l'anestesia locale, in quanto, trattandosi di pun­ture con aghi sottilissimi, la lesione prodotta è equivalente a quella di un'iniezione intra­muscolare. Inoltre non si rende necessaria nemmeno l'incisione cutanea, che potrebbe es­sere giustificata dal bisogno di evitare eventuali contaminazioni da parte dell'epitelio malpighiano della cute.

Per alcuni organi l'agobiopsia ha avuto in passato scarsa applicazione, poiché non rari erano gli incidenti. Per il polmone, per esempio, questa indagine è stata per decenni limita­ta ad esami batteriologici, poiché in citologia si avevano diversi decessi causati da penetra­zione di aria nei vasi polmonari (embolia gassosa). Questo incoveniente, però, si è ridotto notevolmente dopo l'uso di aghi con diametro molto sottile.

Quando si ha la necessità di indagare su strutture o neoformazioni situate nello spessore di un parenchima, è consigliabile usare un ago munito di mandrino, in modo da evitare contaminazioni.

PREPARAZIONE DEGLI STRISCI

II materiale aspirato viene spruzzato su vetrino, badando di depositare sul vetrino tutto il contenuto dell'ago tramite lavaggi in soluzione fisiologica e soluzione tampone. La pro­cedura, a seconda del metodo di colorazione usato, può subire alcune variazioni. Alcuni laboratori preferiscono fissare il materiale strisciato mediante air-dryng, altri invece in al­cool. Le colorazioni maggiormente usate, oltre alla tecnica di Papanicolau e altri metodi di routine o speciali, sono il Wright (Wright-Giemsa) e la colorazione panottica di Pap-penheim (May Grunwald -Giemsa).

Oltre che per la diagnostica citologica, i preparati di materiale agoaspirato vengono adoperati nel campo della ricerca per eseguire analisi enzimatiche quantitative per studiare gli effetti della radioterapia mediante indagini citofotometriche e biologiche.

Principalmente tale indagine si esegue su: mammelle, linfonodi, prostata, ghiandole sa­livari, tiroide, midollo osseo (sterno) e in qualsiasi nodulo patologico comprese le cavità cistiche.

TECNICHE CITOLOGICHE

Tutte le tecniche citologiche prevedono 3 fasi: il prelievo, la fissazione e la colorazione. Le tecniche di prelievo sono state illustrate durante l'esposizione della citologia dei di­versi apparati.

Fissazione

Per colorare un preparato citologico è necessaria innanzitutto la fissazione del mate­riale. Questa può essere fatta sul vetrino, sul materiale centrifugato, o sul prezzo fresco. È importante che venga fatta rapidamente, anche se i preparati possono essere conservati per giorni o per qualche settimana, a condizione che siano già stati strisciati su vetrino e immersi in un liquido fissativo. La fissazione a secco a temperatura ambiente è general­mente usata in ematologia.

Originariamente, Papanicolau propose l'uso di una miscela composta da alcool etilico al 95% ed etere in parti uguali, che ancora oggi rimane uno dei migliori fissativi. L'aggiun­ta di acido acetico all'alcool - etere (in ragione del 20%) fissa meglio i nuclei ma tende ad abbassare il pH. Questa miscela è inoltre molto infiammabile. Attualmente sono molto in voga fissativi spray (Merckofix), che hanno anche il vantaggio di redistribuire il materiale striasciato in maniera più uniforme.

Il tempo ottimale di permanenza del vetrino in fissativo è di circa 15'.

I preparati fluidi (espettorati, lavaggi bronchiali etc) necessitano di centrifugazione per separare il materiale cellulare dal liquido. Il materiale fresco può essere sottoposto a cen­trifugazione anche prima di essere fissato, ma se la rimanente procedura non è immediata conviene mescolare al liquido una quantità uguale di alcool a 70° denaturato.

La centrifugazione deve durare 10-15'a circa 1800 rpm.

Colorazione

Un buon metodo di colorazione deve avere, in citologia, due requisiti fondamentali:

a) avere affinità per il nucleo e la cromatina nucleare;

b) colorare distintamente il citoplasma.

Dal punto di vista chimico tali colorazioni si accostano molte alle colorazioni 'totali' istomorfologiche, ma se ne differenziano per l'azione meno aggressiva; in pratica si usano coloranti più delicati in quanto debbono agire su cellule singole. In questa sede esporremo solo il metodo di Papanicolau, che è quello universalmente usato. Riguardo alle colorazio­ni speciali usate in citologia rimandiamo al capitolo relativo alle colorazioni istochimiche.

Metodo di Papanicolau

- Fissare in alcool-etere o mediante fissativo spray (Merckofix)

- Reidratare e lavare in acqua

- Ematossilina di Harris per 5 '

- Immergere in HCl sol. acquosa 0.5% (6 volte)

- Serie ascendente degli alcool

- Orange G 2% in soluzione acquosa per 2'

-          Lavare in alcool 95 ° (2 volte)

-Eosina Azur (EA) 50 o EA 65 per 1-2

- Lavare in alcool 95°

Risultati:nuclei blu-violetto, citoplasma rosa o verde a seconda dello stadio di maturazione delle cellule.

 

Capitolo XIII

TECNICHE SPECIALI CHIMICHE

La ricerca morfologica si avvale oggi di tecniche che si sono aggiunte a quelle tradizio­nali. Esse permettono di osservare, descrivere e valutare nei più fini dettagli i vari aspetti morfologici e funzionali delle cellule, dei tessuti e degli organi, fino a giungere a livelle molecolare. Infatti oggi nella quotidiana attività di ricerca il morfologo si avvale, oltre che delle tecniche istologiche tradizionali, anche di tecniche istochimiche, istoenzimatiche ec immunoistochimiche.

Per dovere di completezza è opportuno illustrare brevemente tutte queste tecniche spe­ciali che vengono oggi impiegate nella ricerca morfologica, con particolare riferimento ; quelle di più agevole attuazione e di significato più univoco.

Si desidera ulteriormente sottolineare che qui si vuole fornire al lettore solo uno schema delle principali indagini di ricerca morfologica oggi in uso, e pertanto per tutte le notizie tecniche più organiche e dettagliate si rimanda ai numerosi trattati specializzati ed ai lavori di ricerca riportati nella bibliografia.

ISTOCHIMICA

Le colorazioni istologiche rivelano solo una generica capacità delle varie strutture cellulari a legare sostanze primitivamente colorate o destinate a dare prodotti colorati aumentando il contrasto dei vari componenti del tessuto e favorendone così l'identificazione. Le colorazioni istochimiche invece sono il prodotto di una vera e propria reazione chimica tra la sostanza colorante e determinati gruppi molecolari delle strutture in esame.

Tali metodi assumono pertanto il significato di rivelatori specifici di determinati gruppi o funzioni chimiche, per cui invece di colorazioni istochimiche si deve parlare di reazioni Istochimiche. Esse permettono di identificare i costituenti chimici particolari del tessuto mediante l'impiego di reazione chimiche specifiche per il tessuto in esame. L'istochimica tende, pertanto, ad evidenziare le sostanze chimiche presenti nell'interno delle cellule e dei tessuti.

Essa può essere quindi definita come l'applicazione alle preparazioni istologiche dei metodi dell'analisi chimica, e permette l'identificazione delle sostanze chimiche nelle loro sedi naturali, cioè all'interno della cellula.

Preparazione del materiale

Tutti i fissativi usati nelle metodiche istologiche comportano modificazioni chimiche: delle strutture in esame, e pertanto non possono essere usati nelle reazioni istochimiche. In questo caso si ricorrere ai procedimenti di congelamento dei tessuti.

Con il congelamento infatti non solo si bloccano i fenomeni autolitici, si indurisce pezzo e si ottiene una perfetta conservazione delle sostanze, ma soprattutto si può procedere alla rapida preparazione di sezioni a scopo di ricerca ed a scopo diagnostico, come durante le biopsie intraoperatorie. Infatti mentre sono necessarie alcune ore per preparare sezioni fissate con i metodi istologici tradizionali, bastano pochi minuti per preparare se­zioni con il congelamento.

Il metodo più semplice di congelamento fa uso del microtomo congelatore, mediante il quale il frammento di organo viene sezionato ma non disidratato. Il pezzo da esaminare viene rapidamente congelato a circa - 70°C mediante getti intermittenti di CO2 e subito se­zionato. Le sezioni così ottenute sono spesse circa 20 micron, e di scarsa qualità. Un se­condo metodo è quello del criostato, che è una cella termostata tra -10° e -30° contenente un microtomo che può essere manovrato dall'esterno. Anche in questo caso il frammento d'organo viene sezionato ma non disidratato. Il pezzo da esaminare viene rapidamente congelato a circa -30°C mediante getti intermittenti di Freon, e subito sezionato. La quali­tà delle sezioni dipende dal corretto e rapido congelamento, che limita la formazione di cristalli di ghiaccio.

Un terzo metodo di congelamento serve per preservare sostanze labili o facilmente solu­bili in acqua (amine biogene, polisaccaridi acidi, glicogeno etc). In tal caso si ricorre alla tecnica del 'freezing-drying', in cui il tessuto è congelato a -40°C sotto vuoto (0.1 - 0.001 Torr.). Questo metodo allontana l'acqua presente nel tessuto facendola passare dallo stato solido a quello gassoso, eliminando la fase liquida; si tratta in pratica della sublimazione (o liofilizzazione) del contenuto idrico. L'inclusione è bene che venga eseguita anch'essa sotto vuoto, in quanto richiede meno tempo e non altera quindi le proteine enzimatiche. Il vantaggio principale dei metodi descritti è quello di evitare l'azione chimica e quindi la formazione di artefatti; essi vengono correntemente impiegati per le ricerche istochimiche.

Colorazioni istochimiche

Mediante i metodi istochimici possono essere identificati, tramite reazioni più o meno specifiche, i seguenti costituenti chimici delle cellulle: a) Proteine, polipeptidi ed aminoaci­di, b) Acidi nucleici, e) Carboidrati, d) Lipidi, e) Catecolamine, f) Sali minerali (anionici e cati onici).

a) Proteine, polipeptidi ed aminoacidi

Le proteine sono macromolecole formate da un numero più o meno elevato di polipepti­di, che a loro volta sono costituiti da diversi aminoacidi, uniti tra di loro per mezzo del le­game pepli dico che si stabilisce tra i gruppi aminico e carbossilico. Chimicamente esse pos­sono essere classificate in semplici e coniugate (cioè legate ad un gruppo prostetico di natu­ra non proteica).

La loro funzione biologica è data dai gruppi laterali, che ne determinano la reattività con questo o quel composto. Istochimicamente, quindi, per determinare la reattività di una proteina ci si avvale di metodi di identificazione che reagiscono con le catene laterali.

Avremo quindi dei metodi per la identificazione con sostanze chimiche delle proteine in generale, per le proteine basiche (istoni), per le glicoproteine, per le lipoproteine, per le nucleoproteine etc.

In questa sede parleremo solo dei principali metodi istochimici per mettere in evidenza le proteine, perché non è nostra intenzione scrivere un trattato di tecniche di laboratorio, ma piuttosto un'introduzione alle varie metodiche per lo studio degli organi ed apparati del corpo umano. Metodi per le proteine in generale

Queste colorazioni sono eseguite quando si voglia stabilire l'entità della natura proteica di un tessuto o di una sostanza. Le migliori (secondo Pearse) sono la reazione di Danieli (tetrazoreazione) e quella di Millon. Con questi metodi l'evidenziazione delle proteine è possibile m quanto i reattivi usati permettono di identificare un discreto numero di ami­noacidi, che sono presenti in tutte proteine.

Buoni metodi però sono anche quelli per la dimostrazione dei gruppi aminici quali la reazione Ninidrina-Schiff (Yasuma e Itchikawa) e quella dall'O-diacetilbenzene.'

Il trattamento con Ninidrina trasforma i gruppi aminici in aldeidi, che vengono poi co­lorate con il reattivo di Schiff. La reazione consiste quindi in una deaminazione, in cui si ha 1 ossidazione ad aldeide e la conseguente riduzione della Ninidrina in Idridantina.

Questa reazione, oltre che dalla Ninidrina, può anche essere ottenuta daìl'Allossana Metodo:

1) Fissare in Zenker

2) Sparaffinare e reidratare le sezioni

3) Trattare per 24 ore con Ninidrina (sol. alcoolica 1%)

4) Prolugato lavaggio in acqua, poi Schiff per 40'

5) Disidratazione, chiarificazione, montaggio in balsamo.

Risultati: proteine in rosso-rosa.

Quando si abbia la necessità di evidenziare particolari tipi di proteine, si fa uso di rea­zioni che abbino la proprietà di interagire con i gruppi laterali reattivi, come avviene nella reazione di Chevremont per i gruppi sulfidrilici.

Reazione di Chevremont

Questa reazione viene usata quando si vogliono mettere in evidenza i gruppi sulfidrilici e quindi le proteine contenenti cisteina. Queste sono presenti nell'organismo specialmente nel o strato corneo degli epiteli Malpighiani (cute), nel pancreas esocrino, nelle cellule B delle isole di Langherans, nell'ipofisi (alfa-cellule e cellule neuroipofisarie secernenti vaso-pressma) etc.

Metodo:

1) Fissare in Bouin (3-4 ore) ed includere in paraffina

2) Sparaffinare e reidratare le sezioni

3) Lavare in acqua distillata

4) Trattare con ferricianuro solfato ferrico per 8' (tre volte)

5) Lavare in acqua distillata ed in soda al 2%

6) Disidratare, chiarificare e montare in DPX (o Entellan)

Risultati: gruppi -SH in blu; se compare colorazione verde la reazione non ha valore.

 Preparazione del reattivo:

 Ferricianuro di K sol. acquosa 0.1 % ...................25 ml  

Solfato ferrico sol. acquosa 1% ......75 ml

Questo metodo si basa sull'azione riducente dei radicali-SH.

b) Acidi Nucleici

Questi componenti cellulari possono essere studiati anche con tecniche autoradiografiche, di frazionamento cellulare, ultrastrutturali e microspettrofotometriche. Gli acidi nucleici rappresentano il gruppo prostetico delle nucleoproteine, che sono istoni, cioè proteine basiche.

Metodo di Feulgen per il DNA-

1) Fissazione per 5' in alcool metilico

2) Lavaggio in acqua distillata per 5'

3) Rapido passaggio in HC1/ Normale freddo per 1'

4) Idrolisi per 7' in HC1/ N a 60°C

5) Interrompere l'idrolisi con rapido passaggio in HC1/N freddo

6) Lavaggio in acqua distillata

7) Passaggio nel reattivo di Schiff per 1 ora

8) Eseguire tre lavaggi di 90" l'uno in acqua solforosa

 Acido Cloridrico IN .................... 10 ml

Sol. acquosa 10% di NaHSO ............ 10 ml

Acqua distillata ......................    200ml

9) Lavaggio in acqua corrente per 10'

|0)Contrasto (facoltativo) in soluzione acquosa 1% di verde brillante per 1'

ll)Disidratare, chiarificare, montare in balsamo

Risultati: il DNA si colora in rosso-magenta; la reazione rimane incolore se c'è stato pretrattamento con desossiribonucleasi.

 Metodo di Unna-Pappenheim al verde di metile e pironina

L'RNA viene colorato dalla pironina, mentre il verde di metile colora il DNA L'affiniità di questo ultimo composto dipende dal grado di polimerazzione del DNA, e scompare se quest'ultimo viene denaturato. La specificità per l'RNA deve essere controllata tramite digestione enzimatica da parte della ribonucleasi, in quanto la specificiità della pironina è meno netta di quella del verde di metile.

Metodo:

1) Fissare in Bouin ed includete in paraffina

2) Sparaffinare e reidratare le sezioni

3) Lavare in acqua distillata

4) Trattare con la seguente soluzione:

 Verde di metile .....................gr 0.5

Tampone acetato O.1M pH 4.4…………100ml

Pironina ..................gr0.2

....

(sciogliere il verde di metile e aggiungere piranina) per 15' a temperatura ambiente

5) Alcool butilico terziario 2' (due volte)

6) Xilolo 10' (due volte)

7) Montare in balsamo

Risultati: DNA in verde, RNA in rosa-rossastro

e) Carboidrati

Data l'importanza dell'evidenziazione istochimica di questi composti ci sembra oppor­tuno descrivere le metodiche usate per la loro identificazione.

I Glicidi possono essere divisi in polisaccaridi semplici (glicogeno), mucopolisaccaridi (acidi e neutri), mucoproteine (mucosa del tratto digerente, alcuni ormoni etc.), glicopro­teine (collagene, sieroalbumina) e glicolipidi.

La reazione fondamentale per la dimostrazione dei carboidrati è senza dubbio la PAS-reazione secondo Me Manus, che si basa sull'azione dell'acido periodico e del reattivo di Schiff.

II reattivo di Schiff ha la proprietà di tingere in rosso i gruppi aldeidici, e l'acido perio­dico ha il compito di produrre gruppi aldeidici partendo dai gruppi glicol.

I gruppi cosi formati si colorano in rosso una volta sottoposti all'azione del reattivo di Schiff. L'importanza della reazione dell'acido periodico è evidente in quanto, tranne che nelle fibre elastiche, non esistono negli altri tessuti gruppi aldeidici liberi. Il reattivo di Schiff è detto anche Leucofucsina, o fucsina bianca, e si ottiene dalla fucsina basica in presenza di SO3 ed pH acido. In seguito, reagendo con i gruppi aldeidici, la leucofucsina si trasforma in fucsina rossa, colorando in rosso i preparati; questo nuovo tipo di fucsina non ha nulla a che vedere con la precedente fucsina.

La reazione PAS (Periodic Acid Schiff) si svolge nella seguente maniera:

1) Fissare, includere, tagliare, sparaffinare e reidratare

2) Acido periodico per 10-15'

3) Lavare in acqua corrente per 10'

4) Reattivo di Schiff per 20-40'

5) Acqua solforosa per 1 ' (tre volte)

6) Lavare in acqua corrente per 10'

7) Contrastare con Ematossilina (facoltativo)

8)  Disidratare, chiarificare, montare in balsamo

Risultati: mucopolisaccaridi in rosso-magenta; a seconda del tipo di glucidi, però, questa reazione può avvenire o meno, per cui i mucopolisaccaridi si dividono in PAS + e PAS-Sono PAS + : polisaccaridi semplici, neutri, glicoproteine, alcuni mucopolisaccaridi acidi (eparina), alcuni lipidi. Sono PAS-: molti mucopolisaccaridi acidi.

Il materiale PAS- può essere messo in evidenza con reazioni specifiche, e, per i mucopoli­saccaridi acidi, si usa spesso il metodo détt'Alcian Blu, oppure il metodo al Ferro colloidale, la reazione di metilazione etc.

Metodo all'Alcian Blu di Mowry

1) Fissare in Carnoy

2) Sparaffinare e reidratare le sezioni

3) Colorare per 30'-1 ora con la seguente soluzione:

Alcian Blu 8GS 0.1% . , . . . .  200 ml

Acido acetico. ..... .6 ml

4) Lavare in acqua distillata

5) Contrastare con Ematossilina (facoltativo)

6) Disidratare, diafanizzare, montare in balsamo

Risultati: mucopolisaccaridi acidi in blu-verdastro; nel caso si volessero anche dimostrare i

mucopolisaccaridi neutri, si può eseguire una colorazione PAS dopo il punto 4. Questa è la reazione di Alcian -PAS secondo Vialli.

i) Lipidi

Questi composti hanno la proprietà di assumere certi coloranti solubili nei grassi (Sudan Nero, Bleu Nilo), ed il meccanismo di colorazione è quello della solubilità differenziale. Il colorante passa cioè da un solvente discreto (alcool) ad uno ottimo (lipidi) senza però le­garsi chimicamente in quanto privo di gruppi reattivi. Esistono inoltre metodi particolari per evidenziare le varie classi di lipidi, e cioè i Fosfolipidi (metodo dell'Osmio tetrossido

-alfa naftilamina o Otan), gli sfingolipidi (idrolisi alcalina con idrossido di Sodio 2N e co­lorazione con Otan), i glicolipidi (PAS), e gli steroidi (reazione di Libermann -Schultz). Per studiare questa sostanza è consigliabile tagliare i pezzi al criostato in modo da evita­re la solubilizzazione da parte di solventi dei grassi, anche se esistono metodi che prevedo­no l'inclusione in Carbowax. Come fissativo d'elezione si usa la formalina neutra tampo­nata.

Metodo al Sudan Nero B (per i lipidi complessi).

1)    Fissare in formalina neutra tamponata

2)    Tagliare al criostato

3)    Colorare in soluzione tamponata di Sudan per 30'

4)    Lavaggio rapido in alcool a 70°

5)    Contrastare in Giemsa per 30' Risultati: lipidi in nero, nuclei in rosso. Reagenti: A)   Soluzione tampone:

Fenolo puro ....................................................gr 16

Alcool 100° .....................................................ml 30

Na2HPO4xl2H20 ……………………………..gr 0.30

 H20 ............…………………………………ml 100

B)   Soluzione di Sudan:

Sudan Nero B ...……………………………gr 0.60

Alcool 100° .....…………………………….ml 100

Lasciare per 24 ore a 37° C

Si mescolano 40 cc della soluzione A) + 60 cc della B); quindi filtrare per aspirazione.

e) Catecolamine

Tutte le tecniche per la dimostrazione istochimica delle catecolamine si basano sulla pre­senza in questi composti dei gruppi chimici difenolo e idrossi-indolo. Pertanto l'adrenali­na, la noradrenalina, la dopamina e la 5-OH Triptamina (o serotonina) sono agevolmente dimostrabili per via istochimica. Le catecolamine sono presenti nella midollare del surre-ne, nei gangli laterovertebrali dell'ortosimpatico, nei paragangli, nelle cellule enterocro-maffini, nei mastociti, nei vasi arteriosi, nelle strutture nervose, nelle piastrine etc. I meto­di più usati per mettere in evidenza le catecolamine sono:

Falck - Hillarp; è basato sull'impiego del freezing-drying e successivo trattamento con vapori di paraformaldeide e osservazione in fluorescenza.

Hillarp - Hokfelt; prevede la fissazione nelle comuni miscele liquide a base di bicromato e cromato di potassio e di formaldeide a pH 5-6 e applicazione di una delle seguenti reazio­ni: 1) Cromaffine 2) lodaffine 3) Argentaffine 4) Diazoreazione alcalina 5) Test allo Xan-tidrolo.

Eranko; è specifico per la noradrenalina, che forma con il formolo un composto insolu­bile facilmente evidenziabile con le successive colorazioni.

Metodo di Falck-Hillarp Dimostrazione delle catecolamine ai vapori di paraformaldeide

1)    Porre sezioni criostatiche (fino a 15 micron) ed asciugare all'aria

2)    Essiccare sotto vuoto in presenza di P2O5 per una notte (le sezioni essiccate possono rimanere sotto vuoto almeno 24-48 ore)

3)    Accendere il termostato almeno 30' prima della reazione e portarlo a +80°C

4)    Porre le sezioni in un recipiente di vetro contenente vapori di paraformaldeide (quo­ziente di umidità 70-90%), chiudere ermeticamente e fare avvenire la condensazione per 60' a + 80° C

5)    Estrarre con i guanti il recipiente di vetro, togliere i vetrini, stando attenti a non respi­rare troppo la paraformaldeide

6)    Osservare al microscopio a U.V. con filtro di eccitazione 50 e con filtro di sbarramen­to II.

N.B. - La reazione è estremamente labile; è necessario osservare e fotografare entro 3-4 ore dalPesperimento.

f) Sali minerali

I minerali si evidenziano previo microincenerimento del preparato istologico in modo da ottenere una specie di scheletro del preparato in esame. La fissazione del preparato de­ve essere condotta in modo da evitare l'introduzione di sali minerali (microincenerimento, o freezing-drying, o alcool-formolo); alla fissazione segue l'inclusione in paraffina e il ta­glio in fettine sottili. Il microincenerimento va condotto in apparecchi particolari ove si raggiungono temperature di circa 600°C per 30-40'. La fettina così preparata prende il no­me di «Spodogramma» che è fragile e igroscopica. I minerali possono essere identificati con tecniche istospettrografiche o con la diffrazione elettronica.

anioni Minerali

i cloruri possono essere evidenziati mediante reazione con i sali di Ag. Gli ioduri sono difficilmente evidenziabili con i metodi di precipitazione, e pertanto si deve ricorrere al microincenerimento. Anche lo iodio tiroideo si può mettere in evidenza con la microspettrografia d'assorbimento in U.V.. Lo ione fosfato si può colorare direttamente, mentre il fosforo in combinazione organica deve essere prima precipitato con molibdato di ammonio. I solfati sono difficilmente identificabili e pertanto la reazione con acetato di Pb è dubbia.

La  ricerca del silicio e dei silicati, importante in patologia, è difficile, e bisogna ricorrere alla istospettrografia d'emissione. Per l'arsenico esistono numerose tecniche ma sono tutte dubbie.

Cationi  minerali

pur se le reazioni istochimiche sono ormai sostituite dalla istospettrografia d'emissione, tecniche in uso sono abbastanza specifiche e permettono di evidenziare il Sodio, il Potassio, il Bario, lo Stronzio, il Berillio, il Magnesio, lo Zinco, l'Alluminio, il Nichel,il Rame, il Mercurio, l'Argento, l'Oro, il Bismuto ed il Piombo. Un discorso a parte merita il Calcio ed il Ferro.

Il calcio si evidenzia con il metodo delle lacche antrachimoniche (es.: alizarina S) che

-mano con il calcio complessi poco solubili e molto colorati. Un altro metodo di colora­rne è quello di sostituzione del calcio ad opera del nitrato di Ag. Lo studio del calcio è

"portante nei processi di osteogenesi e di ossificazione. Il ferro può essere evidenziato solo se è libero e ionizzato, e pertanto esso va staccato dal legame tetrapirrolico dell'emoglobina mediante uso di acidi forti e poi va colorato con ferrocianuro di Potassio (Metodo di Perls).

ISTOENZIMOLOGIA

Al pari dei catalizzatori chimici, gli enzimi sono sostanze che aumentano la velocità di reazione agendo su un substrato specifico. A differenza dei primi essi prendono parte attiva alla reazione, salvo poi a riacquistare la primitiva struttura.

Sono formati da una proteina complessa (apoenzima) e da un centro attivo (coenzima) che non è necessariamente di natura proteica.

Nel preparare i tessuti per l'indagine istoenzimatica bisogna tener presente che gli enzi­mi sono sostanze molto labili, per cui bisogna agire su pezzi freschissimi ed evitare la fissa­zione. Questa infatti, denaturando le proteine, interagisce anche con gli enzimi, che sono solitamente di natura proteica. I preparati vanno quindi tagliati al criostato e lavati in lampone neutro, poi sottoposti alla reazione. Non tutti gli enzimi sono però identificabili .biochimicamente, in quanto, oltre ad essere presenti in piccole quantità, alcuni di essi de­positano il prodotto di reazione lontano dal sito in cui la reazione è avvenuta; come ad es. accade per gli enzimi idrosolubili.

L'identificazione di un enzima non è altro che un artefatto, in quanto noi possiamo evi­denziare l'attività sul substrato specifico, e non la molecola vera e propria; è il prodotto di reazione che noi osserviamo al microscopio, non l'enzima.

A seconda della loro funzione chimica gli enzimi possono essere così classificati:

1) Ossidoreduttasi - deputati al trasporto dell'ossigeno (perossidasi, citocromossidasi etc.)

2) Deidrogenasi - trasportano una molecola di idrogeno da un substrato ad un altro

(lattico-deidrogenasi, succinino-deidrogenasi etc.)

3) Idratasi - la scissione dei legami chimici che essi operano sul substrato porta alla forma­zione di una molecola d'acqua (es. fostatasi)

4) Trans/erosi - trasportano radicali chimici (—NH2, —CH3 etc.)

5) Liasi - scindono i gruppi chimici (C-C, S-C, etc.)

6) Sintetasi - sintetizzano composti chimici (C-C, S-C, etc.)

7) Isomerasi - determinano la stereoisomeria dei composti chimici (es: glucosio).

L'istochimica, finora, ha dimostrato principalmente gli enzimi appartenenti ai primi tre gruppi, ed è quindi di questi che ci occuperemo brevemente.

1) Ossidoreduttasi

Perossidasi

Sono enzimi che scindono l'acqua ossigenata (H2O2) in H2O -i- O2: per dimostrarli ci si avvale della benzidina, che viene ossidata dall'ossigeno nascente e forma un precipitato verde, la benzopurpurina. Soluzioni:

a) soluzione di benzidina:

benzidina ..................................... mg 50

acqua distillata ............................... ml 200

sciogliere la benzidina a 80°C, far raffreddare e filtrare

b) NH4C1 ...................................... gr 40

acqua distillata ............................... ml 100

Preparare la soluzione (satura) a caldo

Medium d'incubazione:

Prendere 1 ml di b), 9 ml di a), una goccia di H2O2 al 3%

ed 1 ml di EDTA 5% in tampone pH 6.

Metodo:

1) Tagliare le sezioni (15-20 micron) al criostato

2) Incubare per 5-15' nel medium

3) Lavare brevemente in tampone o acqua di fonte

4) Contrastare con eosina per 20"

5) Lavare brevemente in acqua corrente

6) Montare in Entellan

Risultati: La perossidasi è indicata da cristalli blu; il prepa­rato si conserva solo per qualche settimana.

2) Deidrogenasi

Lattico-deidrogenasi (LDH)

Medium d'incubazione:

Na Lattato (0,2M) ............................... ml 1

NBT (0.5 ml/ml H2O) ........................... ml 1

NAD (3 mg/ml H2O) ............................ ml 1Tampone fosfato O.1M pH 7.4 .................... ml 1

Metodo:

1) Sezioni criostatiche di 20 micron

2) incubare nel medium per 30' a 37°C

3) Sciacquare in acqua neutra

4) Fissare in formalina al 10% per 5'

5) Asciugare in termostato e montare in Entellan

Risultati:

l'attività enzimatica è indicata da depositi blu o porpora

scuro.

La LDH fa parte di quella famiglia di enzimi che trasportano una molecola di idrogeno da un substrato ad un altro. Il centro attivo di questi enzimi è un nicotinamidedinucleotide ed è questo che funge da accettore e donatore di idrogeno. La LDH in particolare, cataliz­za la reazione che porta alla formazione di acido piruvico dall'acido lattico (e viceversa); è quindi un enzima della via glicolitica.

La LDH è localizzata principalmente nel tessuto muscolare, nel miocardio, nel rene e nel fegato. 3) Idrolasi

Metodo di Gomori e Danielli per la fosfatasi alcalina

1) Fissare i pezzi in acetone per 15-16 ore

2) Benzolo per 1-2 ore

3) Inclusione in paraffina

4) Sparaffinare, lavare in acqua' per 5-60'

5) Incubare, le sezioni a 37°C per un tempo compreso tra 2-48 ore (media 4 ore) nel seguente medium:

Glicerofosfato di Na (2%) .................... ml 20Veronal di Na al 2% ......................... ml 20

Nitrato di Ca al 2% .......................... ml 10

Acqua distillata ............................. ml 50

6) Sciacquare in nitrato di Ca al 2%

7) Lavare per 2' in nitrato di Ca al 2%

8) Sciacquare in acqua distillata

9) per 1 ' in una soluzione di NH4S.H2O (solfuro di ammo­nio) (5-10 gocce in 500 ml di acqua)

10) Sciacquare per 5-10' minuti in acqua di fonte

11) Disidratare, chiarificare, montare in balsamo.

Risultati: l'attività fosfatasica risulterà colorata in nero.

Le fosfatasi possono essere divise in fosfomonoesterasi, fosfodiesterasi, pirofostatasi. La fosfatasi alcalina appartiene al gruppo delle fosfomonoesterasi. L'attività di questi en­zimi si esplica soprattutto nei processi di formazione e decalcificazione delle ossa (forma­zione di «sali ossei»), nonché nei fenomeni di assorbimento della mucosa gastrointestinale (specialmente del duodeno) e dei tubuli renali.

IMMUNOFL UORESCENZA

Da quando Coons mise a punto la tecnica per marcare gli anticorpi con sostanze fluore­scenti, questa metodica ha avuto una larga diffusione. In seguito, la realizzazione di un composto stabile quale l'Isotiocianato di Fluoresceina, ha permesso di poter usufruire di preparati stabili, più sensibili e più facili da maneggiare.

Le tecniche utilizzate per evidenziare antigeni od anticorpi sono molteplici, ma si posso­no ricondurre principalmente a due:

— // metodo diretto

— Il metodo indiretto

II metodo diretto

Si effettua mediante colorazione con fluorocromo dell'anticorpo corrispondente all'antigene da determinare. L'inconveniente di questo metodo è che si devono adoperare tanti anticorpi quanti sono gli antigeni.

In linea generale la tecnica è la seguente:

1)      Deporre il tessuto contenente l'antigene sul vetrino

2)      Incubare in camera umida l'antigene con anticorpo marcato per un tempo che varia a seconda del tipo di reazione, ma che in media è di circa 30' (la camera umida è ottenibile mettendo i vetrini in una capsula di Petri umidificata con un foglio di carta bibula bagnata con acqua)

3)      Lavare con tampone Fosfato Salino (PBS); questo passaggio va eseguito scrupo­losamente, lavando più volte il vetrino e cambiando il tampone dopo ogni lavag­gio. Questa operazione si rende necessaria in quanto è necessario asportare l'ec­cesso di anticorpo fluorescente.

4)      Asciugare i vetrini a T° ambiente o (meglio) con un getto di aria calda

5)           Osservare al microscopio all'ultravioletto                                         

Il metodo indiretto

Con questo sistema la reazione diviene più complessa della precedente in quanto si usa un anticorpo supplementare, cioè un'antiglobulina marcata. Questo tipo di reazione ha però il vantaggio di adoperare sempre una sola specie di composto marcato, tenendo con­to ovviamente che l'antiglobulina deve essere contro la specie animale che ha fornito l'antisiero.

La tecnica generale con il metodo indiretto è la seguente:

1)      Deporre l'antigene sul vetrino

2)      Deporre sulla sezione l'antisiero corrispondente ed incubare a 37°C in camera umida

3)      Lavare per tre volte i vetrini in tampone

4)      Coprire la sezione con globulina antisiero coniugata con il fluorocromo

5)      Lavare per tre volte in tampone

6)      Montare i vetrini in glicerina tamponata (questo procedimento si può effettuare anche con il metodo diretto)

7)      Osservare con il microscopio all'ultravioletto

Dato che la reazione alPimmunofluorescenza è basata sul legame tra antigene ed anti­corpo, può capitare che uno di questi ultimi interagisca con un antigene cross-reagente, per cui il risultato potrebbe risultare falsato e verrebbe compromessa l'interpretazione. A questo proposito esistono varie prove per controllare la specificità di reazione. Esempi di controllo di specificità:

a -     sostituire l'antisiero con un altro di specie animale diversa b -    non eseguire la reazione (vetrino bianco - serve anche ad evidenziare eventuali so­stanze autofluorescenti presenti nel tessuto) e -     usare un siero normale invece dell'antisiero

In ogriuno di questi casi se la reazione è stata eseguita correttamente, non dovrebbe comparire fluorescenza.

È noto che alcune sostanze tissutali sono autofluorescenti, tipo la vit A, le lipofuscine, le porfirine, le fibre elastiche, le fibre collagene ed in genere tutte le proteine complesse.

Generalmente le reazioni con l'impiego di sostanze fluorescenti si effettuano con pezzi freschi, in quanto molto spesso le sostanze da osservare sono denaturabili al trattamento con solventi usati convenzionalmente, ed anche perché la paraffina usata per le inclusioni è autofluorescente.

Sono state però descritte metodiche con sezioni convenzionali, incluse cioè in paraffina previa inclusione in formalina. Naturalmente questi metodi si discostano da quelli usati per l'istologia classica, tenendo conto delle proprietà dell'antigene da esaminare. Questi metodi hanno però il vantaggio di dare un maggior dettaglio morfologico ed una minor in­terazione da parte di sostanze cross-reagenti che risultano denaturate nei vari passaggi che vanno dalla fissazione all'inclusione, oltre che dalla digestione in tripsina.

 

Capitolo XIV

TECNICHE SPECIALI FISICHE

Oltre alle tecniche speciali di chimica, delle quali abbiamo parlato nel precedente capito­lo, la morfologia moderna si avvale anche di tecniche speciali di fisica.

Quelle che trovano maggior impiego nella ricerca morfologica sono l'istofotometria, la diffrazione ai raggi X, l'autoradiografia e le tecniche di frazionamento cellulare.

La descrizione di queste tecniche è riportata in dettaglio nei testi specializzati. Nel pre­sente capitolo ci limitiamo a fornire soltanto quelle informazioni che sono necessarie al morfologo per una corretta interpretazione dei risultati che si ottengono dalla applicazio­ne di tali tecniche alla ricerca morfologica.

ISTOFOTOMETRIA

L'assorbimento della luce da parte delle sostanze chimiche permette di misurarne la concentrazione in un determinato tessuto. L'esecuzione di un'analisi di questo tipo richie­de la conoscenza della zona dello spettro in cui la sostanza in esame ha il massimo assorbi­mento, e l'uso di strumenti denominati fotometri. La differenza d'intensità delle radiazio­ni luminose che hanno attraversato il preparato si misura con una cellula fotoelettrica, che trasforma l'intensità della luce in differenza di potenziale elettrico misurabile con un nor­male galvanometro.

Questo metodo è regolato dalla legge di Lambert e Beer che dice: «// grado di assorbimento di una radiazione luminosa monocromatica da parte di una so­stanza è direttamente proporzionale alla concentrazione della sostanza assorbente, ed è in­dipendente dall'intensità della sorgente luminosa».

Circa la dimostrazione della legge di Lambert e Beer si rimanda a testi specifici.

L'istofotometria studia pertanto la concentrazione di una sostanza tramite l'impiego di una sorgente di radiazioni luminose, che viene resa monocromatica mediante strumenti denominati monocromatori.

Questo metodo, però, è valido solamente per sostanze colorate, in quanto la sensibilità non è così elevata da permettere il discernimento anche delle sostanze non colorate.

La spettrofotometria e la spettroscopia, invece, si applicano su tessuti non colorati, e misurano l'assorbimento delle radiazioni da parte delle componenti del tessuto stesso.

Lo spettrofotometro esegue quindi tutte le operazioni del fotometro, solamente che la maggiore sensibilità gli permette di indagare nell'ambito di tutte le lunghezze d'onda con­tenute nello spettro luminoso, fino a costituire delle curve spettrofotometriche in cui sono indicati i valori massimi e minimi di assorbimento di una determinata sostanza.

La differenza esistente tra spettrofotometria e spettroscopia è che quest'ultima fa uso di una luce bianca, quindi non monocromatica. Un condensatore convoglia la luce sul prepa-rato, ed all'uscita avremo solo le radiazioni che non sono state assorbite che, impressio­nando una lastra fotografica, possono essere misurate tramite un fotometro eventualmen­te munito di fotomoltiplicatore, consentendo così anche la registrazione di radiazioni di debolissima intensità.

Le misurazioni debbono essere eseguite paragonando uno standard noto al preparato in esame. Si esegue cioè prima la misurazione di un punto noto, ed in seguito di un altro con il preparato istologico in esame.

All'esame spettrofotometrico si prestano molto gli acidi nucleici, che assorbono eletti­vamente la luce U. V. alla lunghezza d'onda di 2600A. Questo assorbimento può essere mi­surato e tradotto in quantità assoluta di DNA e RNA presenti nella cellula (fig.21 ).

Per stabilire se l'assorbimento è dovuto all'uno o all'altro acido si ricorre al pretratta­mento con ribonucleasi e desossiribonucleasi. Le aree d'assorbimento rimosse da un enzi­ma specifico possono essere quindi attribuite al substrato corrispondente.

L'indagine sugli acidi nucleici può essere eseguita anche con la microspettrofotometria, mediante la visualizzazione del preparato tramite un microscopio speciale annesso al foto­metro, che ci da quindi l'immagine diretta e non cifre da riportare su un diagramma.

DIFFRAZIONE A RAGGI X

Non sempre le leggi della propagazione rettilinea della luce sono valide; in determinate circostanze la luce può incontrare ostacoli e questo accade quando le dimensioni delle strutture da esaminare sono dello stesso ordine di grandezza di quello della lunghezza d'onda della luce.

Questo fenomeno è definito 'diffrazione', ed interessa anche le radiazioni e gli elettroni.

Qualsiasi sostanza, colpita da raggi X, assorbe le radiazioni solo in parte, in quanto una certa quantità passa inalterata ed un'altra viene diffratta.

La diffrazione dipende dalla natura delle sostanze e l'immagine è tanto più chiara quan­to più semplice è la struttura da attraversare. Le rappresentazioni migliori si hanno con le sostanze cristalline.

La tecnica della diffrazione a raggi X consiste nel far attraversare il materiale da esami­nare da un raggio collimato e monocromatico di raggi X e nel registrare su una lastra foto­grafica la diffrazione ottenuta. L'immagine dipende dalla disposizione degli atomi e delle molecole nel campione da esaminare, e può apparire come una serie di macchie o bande concentriche.

L'irregolarità della struttura ed il gran numero di atomi presenti nelle macromolecole biologiche rendono ardua un'indagine di questo tipo, che trova larga applicazione in cri­stallografia. Tuttavia l'impiego della tecnica diffrattometrica a raggi X ha condotto alla determinazione della struttura dell'emoglobina e mioglobina, ed ha fornito importantissi­mi contributi all'analisi della struttura del DNA, del collagene e di altre macromolecole.

4UTORADIOGRAFIA

Questa tecnica è adoperata per studiare il metabolismo cellulare mediante l'impiego d: metaboliti marcati con isotopi radioattivi. La distribuzione di radioattività nella cellula viene rivelata tramite emulsioni fotografiche, costituite generalmente da cristalli di bro­muro di Ag sospeso in un mezzo disperdente (gelatina). La sezione con il preparato istolo­gico contenente il materiale radioattivo viene rivestita, in camera oscura, da un sottile stra­to di emulsione fotografica, e posta in frigorifero per un certo periodo di tempo, detto 'tempo di esposizione'. Durante questo tempo i radioisotopi emettono particene ionizzanti che vanno a colpire i cristalli di bromuro dell'emulsione, producendo la cosiddetta imma­gine latente. Questa consiste nel deposito dello Ag metallico solo in alcuni punti dell'emul­sione, detti punti sensibili.

Successivamente si procede allo sviluppo fotografico, durante il quale l'immagine laten­te funge da catalizzatore per la riduzione del cristallo di bromuro d'Ag ad Ag metallico, che apparirà come un grano nero nella sezione. Il fissaggio fotografico elimina i cristalli di bromuro non ridotti, ed indurisce la gelatina.

Al microscopio si esamina sia il preparato che l'emulsione (a contatto), per cui i granuli neri rivelano la distribuzione di isotopi nel tessuto.

Questo metodo rivela però esclusivamente i momenti metabolici di una cellula, in quan­to un tracciante non si lega a nessun costituente cellulare se in quel momento non avvengo­no i processi che utilizzano la sostanza che si vuole marcare.

Molto importante è la scelta del radioisotopo che può anche non avere la proprietà di penetrare nella cellula.

Il costituente cellulare scelto come precursore deve essere inoltre altamente specifico, poiché l'immagine indica l'isotopo e non la molecola che lo ha incorporato. Nella ricerca degli acidi nucleici, per esempio, si adopera la timidina-3H per il DNA, e l'Uridina + 3H per il RNA, stabilendo ovviamente la specificità della reazione con digestione enzimatica (DNAsi e RNAsi). Per le proteine si adoperano aminoacidi -3H.

Le radiazioni impressionano l'emulsione fotografica per un'area equivalente al percor­so massimo delle particelle emesse, e due sorgenti adiacenti sono distinguibili solo se non si incrociano. La distanza che deve separare due punti radioattivi è detta potere di risoluzio­ne. Nel caso del tritio (3H) che emette radiazioni beta estremamente molli con un'energia media di 5.5 Kev ed un percorso medio nell'emulsione inferiore ad 1 micron, il potere di ri­soluzione si aggira intorno ad 1,8 micron.

Questa inoltre è inversamente proporzionale al tempo di esposizione ed allo spessore del preparato. Il buon esito della indagine deve quindi prevedere un giusto tempo d'esposizio­ne ed una certa sottigliezza delle sezioni, che non devono superare i 3-4 micron. La miglio­re risoluzione si ottiene con sezioni semifini di 0,25-0,5 micron.

La possibilità di indagare sugli eventi metabolici delle cellule tramite l'autoradiografia ha esteso considerevolmente i confini della istochimica, i cui compiti riguardavano in pas­sato la localizzazione e la valutazione quantitativa dei costituenti chimici delle cellule e dei tessuti.

FRAZIONAMENTO CELLULARE

Questo metodo consiste nel separare i vari organuli dalla cellula mediante centrifugazio­ne, e rende possibile studiare le diverse frazioni mediante indagini morfologiche e biochi­miche. Le tecniche di frazionamento cellulare si possono suddividere nella seguente ma­niera:

1) Omogenizzazione dell'organo; 2) Separazione delle frazioni ottenute mediante centrifugazione

3) Caratterizzazione delle frazioni.

1) Omogenizzazione dell'organo

II tessuto da esaminare va ridotto in frammenti ed accuratamente pesato.Quindi si im­mergono i frammenti m un volume noto di una soluzione di saccarosio e si pongono in un tubo di vetro. Nel tubo si inserisce in seguito un pestello di teflon collegato ad un apparec­chio omogemzzatore, che gli imprime un movimento rotatorio a velocità variabile a secon­da degli organuh da esaminare successivamente.

Per evitare che il calore sviluppato dell'attrito fra il pestello e la sospensione possa pro­vocare danni alle cellule ed al tubo di vetro, è opportuno immergere quest'ultimo in un re­cipiente contenente ghiaccio. La durata dell'omogenizzazione è in rapporto alla quantità del tessuto da pmogenare. E da tener presente che maggiore è la durata della omogenizza-zione maggiori sono i danni che si arrecano alle frazioni subcellulariLa composizione delle soluzioni in cui è immerso il frammento di tessuto varia a secon­da degli organuh da esaminare. Il saccarosio, a concentrazioni molari diverse  è molto usato per separare macromolecole o componenti subcellulari (mitocondri)

 2) Separazione delle frazioni ottenute mediante centrifugazione

I vari componenti cellulari, avendo differente coefficiente di sedimentazione, si deposi­tano m tempi diversi sul fondo della provetta della centrifuga. Questa proprietà è sfruttata per separare i vari organuli cellulari medante centrifugazione. Le tecniche di separazione pnncip3.il sono ', a) centrifugazione differenziale

Si sottopone l'omògenato a forze centrifughe crescenti, in una centrifuga refrigerata La prima centrifugazione divide l'omogenato in due parti: il sedimento ed il supernatame' II sedimento e costituito da fibre connettivali e detriti. Il supernatante viene centrifugatouna seconda volta, e si ottiene di nuovo un sedimento ed un supernatante. Si procede di se­guito a centrifugazioni crescenti come tempo e numero di giri/minuto, fino ad isolare aci­di nucleici, proteine e macromolecole.

Pur se da un punto di vista teorico questa metodica consentirebbe di separare i vari or-ganuli intracitoplasmatici, in pratica le frazioni ottenute mediante centrifugazione diffe­renziale non sono mai omogenee, in quanto risultano inquinate da diversi organelli. Fra­zioni cellulari più pure si possono ottenere mediante centrifugazione in gradiente di inten­sità. b) centrifugazione in gradiente di densità

L'omogenato viene stratificato nel mezzo di sospensione, che è costituito da soluzioni a densità decrescente, stratificate l'una sull'altra.

La centrifugazione, eseguita ad alta velocità, si protrae per parecchie ore, ed alla fine le frazioni subcellulari si raccolgono in quei tratti della provetta della centrifuga che conten­gono soluzioni aventi la loro stessa densità. 3) Caratterizzazione delle frazioni

Lo studio biochimico degli organuli intracellulari mediante frazionamento cellulare è possibile solo se le frazioni sono omogenee, cioè formato da un solo tipo di organulo, e se le particelle sono integre sia dal punto di vista morfologico che da punto di vista biochimi­co.

La purezza delle frazioni dipende dalla accuratezza dei metodi di centrifugazione, l'inte­grità morfologica si controlla mediante esami al microscopio a contrasto di fase ed elettro­nico, e l'integrità biochimica si valuta cercando, nelle frazioni subcellulari ottenute, la pre­senza dei composti chimici e degli enzimi peculiari per quelle determinate particelle.

Pur se attualmente non si è raggiunto il grado di perfezione tale da permettere lo studio di frazioni purissime, molti progressi sono stati fatti nel campo delle metodiche di frazio­namento cellulare, e le ricerche in corso lasciano intravedere ulteriori perfezionamenti di queste tecniche.

 

 Capitolo XV

METODI DI OSSERVAZIONE DI TESSUTI E CELLULE «IN VIVO»

Sebbene la maggior parte degli studi, nel campo dell'Anatomia Microscopica, si basa sull'esame di organi e tessuti morti, va diffondendosi sempre più l'uso di metodiche di in­dagine su materiale vivente.

 

ESTERIORIZZAZIONE

Questo metodo, applicabile ad animali di piccola taglia, permette lo studio dal vivo di organi che, provvisti di un peduncolo vascolare sufficientemente lungo, possono essere estratti dalla cavità che li contiene. In seguito gli organi vengono posti in camera umida e studiati al microscopio (a piccolo ingrandimento) previa illuminazione (transilluminazio-ne). La scelta degli animali di piccola taglia è determinata dal fatto che la piccola mole dei loro organi permette una buona transilluminazione, e quindi una discreta visualizzazione per trasparenza.

Con questo metodo sono state studiate le cellule pancreatiche sotto l'influenza di vari agenti farmacologici, il fenomeno dell'ovulazione e la dinamica della circolazione in sva­riati organi del ratto.

Gli unici inconvenienti di questa tecnica sono la brevità delle osservazioni ed il basso po­tere di risoluzione dei microscopi adoperati per eseguire questa indagine.

CAMERA TRASPARENTE

II metodo classico consiste nell'installare due camere di vetro e metallo nelle orecchie del coniglio, e di trapiantare fra le camere stesse il tessuto da esaminare. La sopravvivenza del trapianto è assicurata dalla vascolarizzazione del tessuto connettivo circostante.

Una camera trasparente naturale è la camera anteriore dell'occhio. Il trapianto autolo-go di piccoli frammenti di tessuto in questa sede ha permesso di studiare l'endometrio al di fuori dell'utero, dimostrando l'ormonodipendenza di questo tessuto, le cui modificazioni cicliche sono risultate non influenzate dal Sistema Nervoso.

COLTURE IN VITRO

La coltura «in vitro» di tessuti o cellule consiste nel mantenere in vita le cellule al di fuo­ri dell'organismo di appartenenza: II concetto;«in vitro» si oppone così a quello di esperi­mento «in viyo», che viene eseguito sull'organismo intero vivente. Affinchè delle cellule e dei tessuti si moltipllchino su un terreno di coltura è necessario innanzitutto la presenza di sostanze nutritive, poi l'assenza assoluta di contaminazioni esterne. L'asepsi deve essererigorosa, e deve interessare non solo la vetreria e lo strumentario, ma anche l'ambiente esterno. Nel caso le colture siano eseguite in serie conviene disporre di una camera sterile (con raggi U.V.).

Il materiale di vetro deve essere puro e non deve contenere nemmeno piccole tracce di As, Pb etc., che, a causa dell'alcalinità dei terreni, possono avvelenare le cellule in coltura. Il lavaggio inoltre deve essere molto accurato, ed il detergente deve essere allontanato me­diante lavaggi "consecutivi in acqua distillata deionizzata, quindi con soluzioni tampone.

La sterilizzazione del materiale può essere effettuata in autoclave, con formalina, con alcool, con radiazioni U.V. etc.

Oltre al terreno ed all'asepsi, è necessaria una temperatura costante di 37°C (per cellule provenienti da animali a sangue caldo), nonché un pH ed una pressione osmotica ottimali.

I mezzi nutritivi possono essere distinti in «naturali» e «sintetici». Il mezzo naturale più usato è il coagulo di plasma, eventualmente arricchito con succo embrionario di pollo. Questo terreno è stato il primo ad essere usato, in quanto la rete di fibrina del coagulo fun­ge da ottima trama di sostegno per le cellule, e l'estratto di embrione di pollo contiene tutti i fattori nutritizi necessari alla crescita.

Oggi sono molto usati i terreni di coltura sintetici, eventualmente addizionati con pla­sma o lattalbumina. Questa scelta è determinata dal fatto che i vari tipi cellulari e gli scopi della coltura (se di crescita o di mantenimento) richiedono terreni altamente specifici, e quelli sintetici rispondono molto bene a questi requisiti.

I terreni sintetici sono costituiti da soluzioni tamponate di aminoacidi, basi puriniche e pirimidiniche, vitamine, zuccheri e sali inorganici, in varia concentrazione. I terreni di uso più comune sono: Plasma, Siero, sospensione di collagene, soluzione salina PBS, (pho-sphate buffered saline), liquido amniotico, estratto embrionario, liquido ascitico e pleuri­co (con aggiunta di eparina), etc.

I metodi di coltura, in linea generale, possono essere divisi in: metodi per la coltura di organi e metodi per la coltura di cellule.

Coltura di Organi - questo metodo viene impiegato per le ricerche soprattutto embriologiche. L'espianto di organo va eseguito rispettando il più possibile la normale architettura e l'integrità della superficie. Il terreno d'elezione è un mezzo solido (plasma coagulato di pollo o agar) cui si aggiunge estratto embrionale, e la coltura va tenuta in termostato a 37°C. La crescita e la differenziazione dell'abbozzo si verificano con modalità analoghe a quelle dell'embrione intero.

Mediante meccanismi microcinematografici è possibile seguire la crescita della coltura con possibilità di analizzare quindi fattori e meccanismi che regolano tale sviluppo.

Coltura di cellule - possono essere ottenute fondamentalmente con due metodi: impiegan­do un frammento di tessuto o una sospensione di cellule libere.

II primo metodo, il più classico, si attua ponendo il frammento di tessuto in un mezzo di coltura che in genere è costituito da plasma coagulato o da estratto di embrione. È preferi­bile usare l'estratto di tessuto embrionale, in quanto ha una più alta attività proliferativa. È indispensabile che lo spessore del tessuto non sia superiore a pochi millimetri.

I metodi per allestire questo tipo di colture sono: la bottiglia di Correi, i tubi rotanti, la goccia pendente, la bottiglia a T

La coltura viene posta in termostato a 37°C, e dopo qualche giorno si può osservare la formazione di un'area di moltiplicazione cellulare intorno al frammento primitivo. Già dalla prima notte, comunque, è possibile osservare la migrazione e la divisione delle cellule poste alla periferia del frammento espiantato. È opportuno eseguire periodici trasferimen­ti della coltura in terreni freschi, allo scopo di assicurare la nutrizione continua delle cellu­le.

A questo metodo, però, si preferisce oggi il «metodo di coltura di sospensioni di cellule libere».

Per ottenere la sospensione cellulare si applica il metodo della digestione enzimatica per mezzo di enzimi proteolitici, che dissociano il tessuto nei suoi elementi costitutivi creando così la sospensione di cellule isolate. Normalmente si lasciano incubare i frammenti di tes­suto per 15' a 37°C in tripsina.

Successivamente, mediante centrifugazione, si separano le cellule dalla soluzione di trip­sina, che viene gettata via. La sospensione cellulare viene di nuovo sospesa in un terreno nutritivo liquido, posta in un recipiente idoneo, e messa ad incubare in termostato a 37°C.

In un primo tempo (poche ore) si ha la sedimentazione e l'adesione sul fondo del conte­nitore delle cellule sospese, poi inizia la proliferazione che, in tali condizioni, è più rapida e rigogliosa che non nelle colture con coagulo di plasma. Il liquido va sostituito due volte alla settimana, e quando le cellule hanno riempito il fondo della bottiglia si procede ad una ulteriore tripsinizzazione in modo da staccare le cellule dal fondo e trasferirle in un'altra bottiglia.

Questo metodo ha permesso di ottenere popolazioni cellulari omogenee, poiché si può arrivare ad elementi derivanti da una singola cellula (linea cellulare monoclonale).

Il metodo delle colture «in vitro» permette di osservare direttamente le cellule viventi, e mediante metodi microcinematografici, si possono studiare le mitosi, il movimento cellu­lare e la struttura microscopica e submicroscopica della cellula.

Gli studi di virologia, inoltre, vengono tutti effettuati su colture 'in vitro', poiché il vi­rus cresce e si sviluppa solo all'interno di una cellula vivente.

Anche se molta strada è stata percorsa, molto bisogna ancora fare per comprendere i meccanismi biologici che regolano il ciclo cellulare. L'importanza di queste acquisizioni è notevole: basta pensare che una perfetta conoscenza della biologia cellulare ci consentireb­be di evitare la sperimentazione sull'animale che, pur con tutti i problemi di ordine pratico che comporta, rimane per il ricercatore l'unica strada valida da percorrere.

MICROMANIPOLAZIONE MECCANICA

Si tratta di una tecnica che consente di studiare la biologia cellulare manipolando le cel­lule ottenute con le colture. Gli strumenti sono estremamente piccoli (microaghi, micro­ganci etc.) e consentono di lavorare sotto il microscopio, che ovviamente sarà adattato all'uso.

I problemi di biologia cellulare studiati mediante la micromanipolazione meccanica ri­guardano gli studi dell'elasticità e viscosità del protoplasma, lo studio delle interrelazioni nucleo-citoplasmatiche, lo studio della funzione, del nucleo mediante enucleazione e tra­pianti nucleari in amebe etc.

 COLORAZIONI VITALI

Per colorazione vitale si intende la proprietà di alcuni coloranti, detti «coloranti vitali», di legarsi elettivamente ad alcuni tipi cellulari, permettendone così l'identificazione e lo studio di particolari funzioni.

Si parla di «colorazione vitale», però, solamente quando il colorante viene iniettato nell'animale"intero; nel caso invece di somministrazione su cellule o tessuti isolati si usa il termine di «colorazione sopravitale».

I coloranti vitali maggiormente usati sono:

Alizarina - la proprietà di questo colorante di essere incorporato elettivamente dalla so­stanza fondamentale dell'osso in via di mineralizzazione ha contribuito molto alla cono­scenza dei processi di ossificazione.

Bleu trypan, Bleu Pinolo, Litio Carminio - detti anche coloranti 'colloidali' essi hanno la proprietà di essere incorporati da elementi cellulari di tipo reticolo-istiocitario (istiociti e macrofagi), dotati come è noto di proprietà granulopessica. L'uso di questi coloranti, quindi, oltre ad evidenziare queste cellule permette anche lo studio del fenomeno della fa­gocitosi.

Bleu di Metilene - in istologia è molto usato per colorare i preparati ottenuti da estempo­ranee, in quanto esplica la sua azione in tempo brevissimo. Vitalmente colora gli assoni delle cellule nervose.

Verde Janus - colora elettivamente i mitocondri. Istochimicamente viene impiegato per l'evidenziazione delle mucine.

Rosso Neutro - vitalmente viene incorporato dai leucociti, dei quali colora le granula­zioni specifiche in rosa (neutrofili), giallo (eosinofili) e rosso mattone (basofili).

 Capitolo XVI

METODI DI INDAGINE RADIOLOGICI

Le radiazioni ionizzanti trovano impiego nella diagnostica medica in quanto sono capa­ci di attraversare oggetti impenetrabili alla luce normale, di rendere fluorescenti alcune so­stanze chimiche e di impressionare le pellicole fotografiche. Il potere di penetrazione è m funzione della massa da attraversare, del tipo di radiazioni utilizzate e della quantità ero­gata nell'unità di tempo. Ogni corpo, quindi, possiede un certo potere di assorbimento che cresce con l'aumentare dello spessore, della densità e del numero atomico degli elementi che lo costituiscono.

L'emulsione fotografica posta dietro all'oggetto da esplorare viene impressionata solo dai raggi che attraversano l'oggetto, e quindi minore è il potere di assorbimento dell'og­getto maggiore sarà il numero di radiazioni che andrà a cadere sulla lastra fotografica, e maggiore sarà l'opacità prodotta. _ ,

È fondamentale entrare in questo ordine di idee: più un corpo è denso, più e radioopaco, meno impressiona la lastra, con un'immagine risultante più chiara. La trasparenza ra­diografica indica quindi radioopacità.

Riteniamo inopportuno dilungarci in questa sede sulla fisica delle radiazioni ionizzanti, rimandando ai testi di fisica e di radiologia per approfondire l'argomento; esporremo in­vece in maniera succinta i vari metodi radiologici che possono risultare utili per uno studio sistematico e topografico dell'Anatomia Umana Normale.

METODI

La diagnostica radiologica usa due principali metodi di indagine: 1) senza mezzo di con­trasto e 2) con mezzo di contrasto. Quest'ultimo metodo può essere eseguito o con mezzi di contrasto radioopachi (con elevato potere di assorbimento) o con mezzi di contrasto ra­diotrasparenti (con scarso potere di assorbimento).

METODI SENZA MEZZO DI CONTRASTO

Radioscopia .        .

Questa tecnica si basa solo sul potere che i raggi X hanno di attraversare i corpi opachi alla luce visibile.

Si pone la parte dell'organismo da esaminare fra un generatore di raggi X ed uno scher­mo su cui è stato spalmato un composto fluorescente. Azionando il generatore noi avremo che lo schermo riprodurrà le proiezioni dell'organo, impressionandosi maggiormente quanto maggiore sarà la quantità delle particelle che lo colpiscono. In questo modo, alcontrario della radiografia, le particelle radioopache risulteranno più scure, in quanto lo schermo sarà impressionato da un numero minimo di elettroni.

L'importanza di questo metodo risiede nel fatto che si può avere la visione del movi­mento degli organi (cuore, diaframma, etc.).

Radiografia

Sostituendo una pellicola fotografica allo schermo fluorescente si verificherà che le par­ticelle, attraversando un corpo, andranno a impressionarla. Come abbiamo già accenna­to, maggiore sarà il numero di particelle che impressiona la lastra fotografica più scura sa­rà l'immagine prodotta. Si tratta in definitiva dì un'immagine equivalente ad un negativo fotografico. Mentre il contrasto fra ossa e parti molli è netto, l'evidenziazione degli organi addominali è impossibile, per cui si ricorre all'artificio di riempirli con sostanze radioopa­che, ad alto numero atomico. Inoltre, se lo studio di regioni poco complesse si può esegui­re anche con una sola radiografia in un'unica posizione, l'esame di strutture con morfolo­gia polimorfa richiede un numero di radiografie più elevato e diverse variazioni di posizio­ne.

Tecniche radiografiche

I tempi di esposizione alle radiazioni possono variare da pochi millesimi di secondo a qualche secondo, a seconda della densità degli organi in esame e del tipo di radiazioni usa­te. La qualità delle immagini radiografiche dipende:

- dalla distanza fuoco-pellicola ed oggetto pellicola; se il primo parametro rimane co­stante, variando il secondo si ingrandisce o rimpicciolisce l'immagine e viceversa.

- dalla limitazione al massimo delle sfumature; per diminuire al massimo le sfumature occorre aumentare al massimo la distanza fuoco-pellicola e diminuire quella oggetto-pellicola. Inoltre bisogna tener fermi il più possibile gli organi molli (per il polmone, per esempio, si fa stare il paziente senza respirare per il tempo della esposizione della pellicola radiografica).

Dato che la sorgente di radiazioni non è mai puntiforme, per evitare la velatura della la­stra provocata dall'espandersi delle particelle in tutte le direzioni si fa uso di griglie anti­diffusione.

Plesioradiografia

È una tecnica idonea allo studio di strutture superficiali, e si esegue ponendo il tubo ca­todico a contatto col paziente e la lastra al lato opposto. È usata maggiormente per lo stu­dio dello sterno, dell'articolazione temporo-mandibolare etc.

Xeroradiografia

In luogo dell'emulsione fotografica fa uso di una sottile lamina di selenio caricata elet­trostaticamente. L'immagine viene riprodotta su carta e risulta più efficace per la dimo­strazione delle parti molli (mammella, muscoli, etc.). Il grosso limite di questa tecnica sta nell'elevato carico di radiazioni che richiede per essere correttamente eseguita.

Stratigrafia e Tomografia Assiale Computerizzata Ci permettono di ottenere la rappresentazione di un solo strato del corpo in esame.

II metodo consiste nell'esaminare il paziente immobile, facendo muovere lungo un arcodi cerchio ed uniformemente la sorgente di radiazioni e la pellicola. Ne risulta, in definiti­va, la riproduzione di un singolo strato dell'organo, in quanto le altre immagini si sovrap­pongono e si cancellano. Molto successo ha oggi ottenuto la tomografia assiale compute­rizzata (TAC).

Questo metodo consente di esplorare diversi distretti dell'organismo mediante un appa­recchio che analizza le immagini ottenute tramite un calcolatore elettronico. Il computer, risolvendo complicate equazioni, ci fornisce i dati anatomici concernenti una sezione del corpo, che può poi essere riprodotta su lastra fotografica o radiografica. L'importanza di questo metodo risiede nel fatto che si possono eseguire sezioni seriale dell'organismo in esame, e la successione delle immagini può essere studiata senza che il paziente debba sot­toporsi ad un nuovo esame, in quanto i risultati sono registrati su nastro magnetico.

METODI CON MEZZO DI CONTRASTO

 

Mezzi di contrasto radioopachi

Si usano generalmente composti di Bario e di Iodio (Solfato di Bario, oli iodati e prepa­rati iodati idrosolubili).

 Arteriografia

II mezzo di contrasto si inietta in una arteria periferica tramite una siringa apposita, cui si sostituisce un catetere che viene diretto nel distretto prescelto (arteriografia selettiva).

Flebografia

Le vene possono opacizzarsi anche in corso di arteriografia (sangue refluo), oppure si procede iniettando il mezzo di contrasto in una vena periferica. Per la splenoportografia si esegue la puntura della milza, che, come è noto, è tributaria del circolo portale.

Linfoadenografia

I linfatici vengono evidenziati dapprima con l'iniezione di un colorante vitale (Tripan Blu), poi, reso visibile il vaso, si inietta il mezzo di contrasto tramite una siringa con ago sottile.

Broncografia

II mezzo di contrasto, che deve essere molto opaco ed idrosolubile, viene iniettato nell'albero bronchiale per mezzo di una sonda (di Metras), che può essere guidata radio­scopicamente nel distretto desiderato.

Tubo digerente

Oltre all'assunzione per os del mezzo di contrasto, si può applicare il metodo del doppio contrasto, che consiste nel far ingerire al paziente una piccola quantità di Solfato di Bario seguita da introduzione di aria. In questo modo si vernicia la parete della mucosa, della quale risulta agevole lo studio delle pliche.

Colecistografia

II contrasto della vescichetta biliare può essere ottenuto sia per via orale che per via en­dovenosa.

La somministrazione di mezzo di contrasto (triiodato) deve avvenire 10-11 ore prima dell'esame, e la contrazione della cistifellea deve essere stimolata tramite l'ingestione di un pasto grasso (uovo).

Urografia

Può essere ascendente e discendente. La prima si ottiene iniettando il mezzo di contrasto per mezzo di un catetere ureterale, la seconda tramite infusione endovenosa lenta o flebo-elisi.

 

Mezzi di contrasto radiotrasparenti

In questo caso si sfrutta la proprietà dei gas (aria, CO2,02), di dare un contrasto natura­le agli organi, e viene usata quando si debbano studiare cavità dell'organismo (mediastino, retroperitoneo) o organi cavi (vescica). La nomenclatura di queste indagini è composta dal nome dell'organo o quello dello spazio in esame preceduto dal prefisso pneumo (es.: pneumo-mediastino, pneumoperitoneo, pneumoretroperitoneo etc.).

 METODI DI INDAGINE CON ISOTOPI RADIOA TTIVI

Biologicamente questi composti si comportano come i corrispondenti non marcati, per cui il rilievo della loro distribuzione nell'ambito di un determinato organo ci da indicazio­ni abbastanza precise sulla funzionalità dell'organo stesso.

Scintigrafia

Si basa su due principi opposti: 1) il tracciante viene captato da tessuti patologici; 2) il tracciante viene captato da tessuti normali. Il tracciante quindi deve:

a)    essere captato o eliminato selettivamente dall'organo in esame;

b)    non deve essere tossico per l'organismo;

e)    agire senza dover somministrare al paziente dosi eccessive;

d)    avere un periodo di decadimento breve;

e)    essere molto stabile.

Le radiazioni emesse vengono captate e riprodotte graficamente da particolari strumenti (scanner per scintigrafia). Le indagini si eseguono principalmente su: tiroide (131-1), ence­falo (203-Hg), fegato (198-Au colloidale), milza (stessi eritrociti del paziente marcati con 51-Cr), osso (85-SrCl2), pancreas (75-Se).

Ecografia

È una tecnica radiologica che, invece di radiazioni ionizzanti, fa uso di ultrasuoni; l'im­magine ecografica, quindi, non è altro che l'eco registrata. Gli apparecchi che generano ul­trasuoni possono dare due tipi di segnale:

A-Mode o metodica unidirezionale o TAU; registra con dei picchi gli echi della struttura in esame;

B-scan o SIMU; l'eco riprodotta si traduce o come un singolo punto isolato o come trat­teggio lineare.

Gli impieghi principali dell'ecografia sono:

1) Strutture endocraniche - con particolare riferimento alla struttura dell'encefalo, alla conformazione dei ventricoli cerebrali ed all'identificazione di processi patologici.

2) Ostetricia - ecograficamente si può seguire la crescita del feto a partire dalla 15a set­timana.

3) Oftalmologia - a scopi sia diagnostici che terapeutici che biometrici.

4) Apparato cardiovascolare - è di ausilio specialmente nelle malattie della valvola mi­trale.

5) Mammella - dato che normalmente questo organo ha echi uniformi, l'assenza (cisti) o l'accentuazione (tumori) drquesti indica la presenza di processi patologici.

Il principale vantaggio dell'ecografia è quello di adoperare ultrasuoni, che sono comple­tamente innocui per l'organismo contrariamente alle radiazioni X, che al di là di una certa soglia risultano dannose.

Capitolo XVII

ESAME RADIOLOGICO DEI VARI ORGANI ED APPARATI

APPARA TO RESPIRA TORIO

L'esame radiologico dell'apparato respiratorio comprende:

— Radiografia del torace - Si esegue in proiezione frontale e laterale, con il paziente in apnea respiratoria.

— Stratigrafia - Permette l'esame in dettaglio delle opacità polmonari, delle dirama-zioni   bronchiali e delle zone di disomogeneità (caverne).

— Broncografia - Si introduce nella trachea o in un bronco principale il mezzo di contra­sto iodato. Questa metodica permette lo studio delle varie diramazioni dell'albero bronchiale. È richiesta anestesia locale o generale.

— Angiopneumografia - Permette l'opacizzazione dei vasi polmonari iniettando il mez­zo di contrasto in una vena del gomito.

— TAC. Permette di riconoscere formazioni di piccole dimensioni non altrimenti identi ficabili.

— Scintigrafia -1 radioisotopi più comunemente usati sono 99-Tc e 131-1. I polmoni so­no rappresentati in relazione alla entità della loro perfusione.

CUORE E GROSSI VASI

— Telecuore - Per esaminare il cuore questo metodo viene eseguito in varie proiezioni. Oltre alle proiezioni frontale e laterale, si eseguono anche due proiezioni oblique: la proiezione obliqua anteriore sinistra (OAS) e la proiezione obliqua anteriore destra (OAD). La proiezione OAD è bene sia eseguita previa opacizzazione dell'esofago.

— Angiocardiografia - Viene eseguita per mezzo di introduzione del mezzo di contrasto in una vena dell'avambraccio. A differenza dell'angiopneumografia, questa indagine necessita dell'introduzione del mezzo di contrasto a velocità maggiore (entro 2") ed in quantità superiori (40-60 cc).

—     Chimografia - Serve ad analizzare i contorni del cuore e fornisce un quadro delle loro modificazioni in relazione alle varie fasi del ciclo cardiaco.

—     APPARA TO DIGERENTE

Nell'esame dell'apparato digerente si debbono distinguere due tipi di indagine: di routi­ne e speciali, legate cioè ad esigenze particolari. Gli esami di routine possono essere così schematizzati:

— Esame diretto dell'addome - Pur se fra i vari organi che costituiscono il tubo digeren­te non esiste un contrasto naturale sufficiente ad ottenere un apprezzabile immagine radiografica, l'esame diretto può essere impiegato per scoprire eventuali malforma­zioni intestinali, soprattutto nel neonato. Nell'intestino normale, con l'esame diretto, si possono evidenziare aree di trasparenza nello stomaco, nel bulbo duodenale e nel colon. Il tenue, nell'adulto, non da immagine radiotrasparente come nel bambino.

— Esame con mezzo di contrasto - È senza dubbio l'esame radiologico più comunemente impiegato per lo studio dell'apparato digerente. Si effettua facendo ingerire al pazien­te, per via orale, il mezzo di contrasto costituito da una sospensione acquosa di solfa­to di Bario (BaSO4). Le varie porzioni dell'intestino si studiano mano mano, con il progredire del mezzo di contrasto. È un esame che richiede tempi lunghi, ed è conside­rato fra le metodiche radiologiche più impegnative. Basti pensare che, dalla visualiz­zazione dell'esofago a quella della porzione prossimale del colon, passa un intervallo di tempo variabile dalle 4 alle 6 ore.

— Esame a doppio contrasto - Pur rappresentando un progresso di grande importanza pratica, questo metodo è molto più indaginoso del precedente. Il metodo consiste nell'introdurre nell'intestino prima il solfato di Bario e poi sostanze che producono anidride carbonica (es: acido citrico), in modo da «verniciare» la parete della mucosa. E indispensabile però una preparazione farmacologica prima dell'esame, in modo da favorire la dilatazione dei segmenti intestinali interessati. Vengono somministrati in genere farmaci ad azione anti-colinergica.

— Clisma opaco (per lo studio radiologico del colon) - Poiché i risultati ottenuti con l'in­troduzione del mezzo di contrasto per via orale sono attendibili solo per il tratto ini­ziale del colon, le restanti porzioni del crasso debbono essere studiate mediante clima opaco. E indispensabile, in questo caso, un'accurata preparazione del paziente, che dovrà sottoporsi ad un totale svuotamento delle scorie alimentari eventualmente pre­senti nel colon. Il mezzo di contrasto viene introdotto per via rettale, e la sua progres­sione seguita radioscopicamente. Dopo l'evacuazione, i residui di solfato di Bario permettono di osservare il colon a «piccolo riempimento».

Gli esami speciali sono i seguenti:

— Scialografia (introduzione del mezzo di contrasto nei dotti escretori delle ghiandole salivari).

— Cineradipgrafia (per lo studio dell'esofago)

—     Arteriografia celiaca (per lo studio dello stomaco) -

—    Duodenaria Ipotonica (somministrazione del mezzo di contrasto dopo trattamento farmacologico anti-colinergico)

- Angiografia mesenteriale (per lo studio dell'intestino tenue)

_ TAC   Sfrutta le differenze di densità degli organi contenuti nella cavità addominale rendendo possibile l'evidenziazione di numerosi particolari.

VIE BILIARI

- Esame diretto - viene impiegato per evidenziare eventuali radioopacità presenti nella regione (calcoli biliari etc.).

_ Colecistografia e colangiografia endovenosa (v. metodi di indagine).

- Colangiografia preoperatoria - Viene eseguita introducendo il mezzo di contrasto nel la cistifellea o nei dotti, durante gli interventi chirurgici.

- Colangiografia postoperatoria - È indicata per controllare la funzionalità delle vie bi­liari dopo intervento operatorio, nel caso, soprattutto, rimanga un drenaggio.

— Colangiografìa percutanea transepatica - Si esegue per mezzo di puntura diretta dei dotti e della colecisti. Richiede, per l'esecuzione, un ambiente altamente specializzato.

— Colangiografìa retrograda - Si esegue nel corso di duodenoscopia, introducendo il mezzo di contrasto nella papilla del Vater. Per questo tipo di esame sono molto indi­cati i fibroscopi a visione laterale (v. endoscopìa).

APPARATO URINARIO

— Esame diretto - Viene impiegato per evidenziare eventuali radioopacità presenti nella regione (calcoli renali, uretrali, vescicali etc.).

— Urografia - Oltre ad evidenziare rene e vie urinifere, questo metodo permette anche dì studiare queste strutture dal punto di vista funzionale. Il mezzo di contrasto ioda­to, introdotto per via endovenosa, viene escreto attraverso il meccanismo di filtrazio­ne glomerulare, e pertanto è possibile visualizzare in tempi successivi il rene ed i vari tratti delle vie urinifere.

— Nefrotomografia - Si esegue in corso di esame urografico. Il mezzo di contrasto deve però essere iniettato in grandi quantità.

— Urografia ascendente o pielografla - Consiste nella evidenziazione delle vie urinifere mediante introduzione del mezzo di contrasto con un catetere. L'avvento dell'urogra-fia per mezzo di fleboclisi, che permette di introdurre grandi quantità di mezzo dicontrasto, ha ridotto di molto la frequenza di questo esame, che fra l'altro non è com­pletamente privo di rischi.

— Cistografia - La vescica può essere evidenziata nel corso di urografia (cistografia da eliminazione), oppure usando mezzi di contrasto trasparenti opachi o misti. La cisto­grafia si esegue in genere insieme alla cistoscopia.

— Uretrografia - Si inietta il mezzo di contrasto nell'uretra, previa introduzione di una cannula.

— Arteriografia - Nell'arteriografia renale si distinguono 5 fasi: 1) fase arteriografica (evidenziazione dell'a. renale), 2) fase nefrografica iniziale (evidenziazione della corti­cale del rene), 3) fase venosa (opacizzazione della v. renale), 4) fase nefrografica tar­diva (opacizzazione di tutto il parenchima), 5) fase escretoria (opacizzazione delle ca­vità pieliche.)

— TAC. Mette in evidenza masse del retroperitoneo, del perineo e del rene.

— Pneumoretroperitoneo. Dall'avvento del TAC è impiegato raramente.

— Scintigrafia - Permette di evidenziare radiograficamente il parenchima renale funzio­nante. Si usa in genere un diuretico marcato con 203-Hg, oppure per mezzo di contra­sto (Hippuran) marcato con 131-1.

SCHELETRO

L'apparato scheletrico viene generalmente studiato con l'esame diretto, anche se esisto­no esami speciali. Alcuni di essi sono:

— Micrografia - È indicata per lo studio della struttura di prelievi intraoperatori di fram­menti di ossa, quando non si voglia procedere ad una precedente demineralizzazione.

— Osteomedullografia - II mezzo di contrasto viene iniettato direttamente nel canale mi­dollare.

— Artrografia - Se l'iniezione del mezzo di contrasto nella cavità articolare viene effet­tuata con un mezzo trasparente si parla di pneumoartro, se con un mezzo opaco di ar-tografia opaca.

— TAC. Studia il contenuto in Calcio dei vari segmenti scheletrici.

—    Scintigrafia - Si usano isotopi di sostanze osteotrope (46-Ca, 85-Sr).

 

Capitolo XVIII

TECNICHE DI ANATOMIA CLINICA

ENDOSCOPIA

Consiste nella ispezione diretta delle cavità del corpo umano comunicanti con l'esterno (es: stomaco, laringe, trachea, bronchi, retto, uretra, vescica etc.) per mezzo di un appa­recchio speciale (= endoscopie) fornito di un sistema di illuminazione a fibre ottiche.

Tale ispezione si esegue con uno strumento che viene introdotto nelle cavità del corpo che debbono essere esaminate. La cavità viene poi illuminata dall'esterno mediante un di­spositivo a fibre ottiche che permette di eseguire anche fotografie dei campi osservati. L'importanza di questo esame è notevole, in quanto permette di evidenziare processi pato­logici in atto senza eseguire interventi chirurgici esplorativi.

L'endoscopia ha avuto particolare sviluppo da quando si è passati dagli endoscopi rigidi e semi-rigidi a quelli attuali flessibili a fibre ottiche di vetro, denominati fibroscopi.

La fibroscopia ha dato notevoli risultati specialmente nella esplorazione visiva diretta della porzione prossimale (esofago, stomaco, duodeno, digiuno e prime anse dell'ileo) e distale (canale anale, retto, sigma, colon, valvola ileo-cecale, ultime anse dell'ileo) del ca­nale digerente. Queste regioni del canale digerente possono essere pertanto definite «zone fibroscopiche», in quanto sono direttamente esplorabili nel vivente mediante il fibrosco-pio. Le tecniche fibroscopiche più usuali applicate al canale digerente sono due:

a) Esofago-gastro-duodenoscopia, che permette l'esame dell'esofago, dello stomaco, del duodeno e della papilla di Valer. La papilla può essere evidenziata con un fibroscopio particolare, il duodenoscopio a visione laterale. Questo permette sia l'evidenziazione della papilla sia l'iniezione di un mezzo di contrasto radioopaco, per osservare radiologicamen­te le vie biliari intra- ed extraepatiche, nonché i dotti pancreatici.

b) Pancolonscopia, usata per l'esame delle porzioni distali dell'apparato digerente. La pancolonscopia può essere divisa in tre parti: rettoscopia, rettosigmoidoscopia e colonsco-pia. La prima viene eseguita con un endoscopie rigido, le altre due con fibroscopi flessibi­li. L'efficacia diagnostica della rettosigmoidoscopia è aumentata se l'esame endoscopico è accompagnato da un esame radiologico.

Un buon sistema per aumentare la resa diagnostica della rettosigmoidoscopia è quello di svuotare completamente l'intestino dal suo contenuto, tramite lavaggi, clisteri o sommini­strazione di purganti.

Una delle principali indicazioni della rettosigmoidoscopia è l'asportazione dei polipi, precedentemente osservati radiologicamente.

La colonscopia, invece, ha le sue indicazioni quando esistono dubbi diagnostici radiolo­gici, quali la necessità di conoscere il tipo istologico di una lesione dubbia, o in caso di cli-sma opaco negativo in pazienti con sintomatologia colica.

I campi di applicazione dell'endoscopia non sono comunque limitati alle indagini relati-li, ma si è ovviato a questo inconveniente con la messa a punto di una tecnica di fissazione che permette una efficace diagnosi istologica anche con la quantità esigua di materiale che si riesce ad ottenere.

La broncoscopia è indicata nella diagnosi del carcinoma bronchiale, nelle malattie inter­stiziali del polmone ed in tutte le sindromi ostruttive specialmente se di tipo progressivo. La broncoscopia può essere eseguita inoltre nello studio funzionale dei singoli lobi e seg­menti polmonari.

Mediastinoscopia

Introdotta da Carlens questa tecnica permette il prelievo bioptico dalle regioni superiore e medio-posteriore del mediastino. La mediastinoscopia permette di evitare la toracotomia esplorativa, che a volte può presentare complicazioni.

Condizione di fondamentale importanza per eseguire questa metodica è la perfetta co­noscenza dell'Anatomia del mediastino, e soprattutto della topografia delle stazioni linfo-nodali mediastiniche. Recentemente i linfonodi mediastinici sono stati così suddivisi:

1) Linfonodi peritracheobronchiali;

2) Linfonodi broncopolmonari;

3) Linfonodi polmonari;

4) Linfonodi mediastinici anteriori

5) Linfonodi mediastinici posteriori.

Le indicazioni della mediastinoscopia sono: la diagnosi del carcinoma broncogeno, le cisti mediastiniche, i linfomi, la tubercolosi, la silicosi, la sarcoidosi etc., oltre ad indagini per gli interventi di timectomia, impianto di pace-makers e così via.

Questa indagine però non viene mai eseguita per prima, in quanto è buona norma farla precedere da altri esami, quali la broncoscopia, ed inoltre la sua esecuzione è subordinata alla inesistenza di linfoghiandole palpabili.

La mediastinoscopia, infatti, si esegue sotto anestesia totale, ed ha il grosso limite di non poter essere ripetuta, in quanto i rapporti tra i vari organi ed anche la via di introdu­zione dello strumento vengono alterati dalla prima indagine.

Lo strumento comprende: il mediastinoscopio, che non è altro che un laringoscopie mo­dificato; un divaricatore a branche lunghe, per isolare i linfonodi; pinze lunghe per la biopsia; aspiratore; aghi lunghi per saggiare le strutture.

L'incisione si pratica trasversalmente nella regione sopragiugulare, come per la tracheo­tomia, e da qui si crea il tunnel per introdurre il fibroscopio ed osservare le strutture inte­ressate.

Amnioscopia

Si esegue per stabilire la maturità del feto in quel momento. Il vecchio reperto semeiolo-gico dell'aumento volumetrico dell'utero (3° mese all'arcata pubica, 6° all'ombelico, 9° alla apofisi xifoidea) è molto empirico, come non sono sufficienti le indagini radiologiche, ecografiche e biochimiche (determinazione di bilirubina e creatinina nel liquido amnioti-co). L'esame più attendibile, in questi casi, è l'amnioscopia. L'amnioscopio viene introdotto nel canale cervicale, previa visualizzazione della portio mediante uno speculum, e quindi si osserva il polo inferiore del sacco embrionale tramite un sistema di illuminazione. L'esame del colore del liquido amniotico può già essere indi­cativo circa l'integrità o meno del feto, in quanto il reperto di liquido amniotico chiaro de­pone per una diagnosi di normalità.

Per stabilire la maturità del feto, invece, si esegue un prelievo di liquido amniotico, e si esamina al microscopio come un qualsiasi reperto citologico. Gli elementi cellulari presen­ti sono due:

1) Cellule epiteliali di tipo squamoso, generalmente isolate;

2) piccole cellule ricche di vacuoli lipidici (cellule «grasse»), disposte a gruppi, con contor­ni irregolari e di probabile derivazione sebacea.

Queste ultime permettono di stabilire con esattezza l'età del feto, in quanto esse aumen­tano con la maturità di quest'ultimo.

L'amnioscopia non comporta assolutamente rischi di infezioni per il teto e per la ma­dre- l'unico inconveniente che si può presentare (25% dei casi) è l'inizio prematuro del tra­vaglio ma, poiché ciò avviene solo in donne con gravidanza a termine, l'eventuale antici­pazione del parto a causa dell'amnioscopia non provoca alcun danno particolare.

Metodi di indagine per la diagnosi prenatale

II progresso e la diffusione delle metodiche di indagine per la diagnosi prenatale ha fatto sì che i rischi legati ala gravidanza venissero ridotti al minimo. La diagnosi prenatale, pe­rò oltre a servirsi dei metodi tradizionali (amnioscopia, cardiotocometna, misurazione dell'equilibrio acido-base, etc.) si serve di altre metodiche più moderne che rivestono par­ticolare importanza:

1) l'Ultrasonografia - Questa tecnica ha ormai assunto un ruolo preminente nella diagnosi prenatale, ed i continui ed incessanti progressi tecnici permettono al medico di ottenere una definizione sempre più accurata dell'Anatomia del feto.

Oltre ad un contributo che si può definire «diretto» (diagnosi precoce di vane malformazioni congenite), l'ultrasonografia può essere agevolmente impiegata come esame preli­minare all'amniocentesi ed alla fetoscopia, nonché come controllo dello sviluppo fetale per la diagnosi di ritardi di crescita intrauterina, che sono legati sovente ad alterazioni ge­netiche del feto.

2) l'Amniocentesi - È la tecnica che maggiormente consente di diagnosticare, mediante esami biochimici e citogenetici, la maggior parte delle malformazioni congenite letali.

Consta di un'aspirazione del liquido amniotico per mezzo di una siringa speciale.

Con questo metodo sono evidenziagli tutte le anomalie cromosomiche (es: mongolismo) le malattie lisosomiali o glicogenosi (provocate da errori congeniti del metabolismo), le malattie ereditarie legate al sesso (es: emofilia) nonché i difetti del tubo

3) laFetoscopia - È un'indagine che permette la" visualizzazione diretta del feto, con la pos­sibilità di eseguire direttamente prelievi ematici e biopsie mirate fetali e placentari.

IL SANGUE

Nel sangue distinguiamo una parte liquida, il plasma, ed una parte corpuscolata. La parte liquida è costituita da acqua, enzimi, sali minerali, protidi, lipidi e glucidi. La parte corpuscolata è formata da globuli rossi (o eritrociti o emazie), globuli bianchi (leucociti), suddivisi a loro volta in granulociti, linfociti, monociti e dalle piastrine.

L''eritrocita è una cellula sprovvista di nucleo la cui funzione è quella del trasporto di os­sigeno ai tessuti. Questa funzione del globulo rosso è resa possibile dalla presenza sulla sua membrana di una emoproteina, l'emoglobina, il cui gruppo prostetico è rappresentato dall'eme, formato da una porfirina (protoporfirina IX) cui è legato un atomo di Ferro.

I granulociti sono cellule che contengono nel citoplasma varie granulazioni, in base alle quali vengono distinti in: neutrofili, basofili, eosinofili. La funzione principale dei granu­lociti è la fagocitosi batterica per i neutrofili, la fagocitosi di immunocomplessi per gli eo­sinofili. Il compito dei basofili non è ancora ben definito.

I linfociti sono cellule molto importanti nell'ambito dei meccanismi di difesa dell'orga­nismo. Sono infatti il sito di produzione degli anticorpi.

Le piastrine intervengono principalmente nel processo della coagulazione. Esse sono an­che produttrici di prostaglandine, una famiglia di ormoni, prodotti anche da gonadi e re­ne, che ha molta influenza sul sistema nervoso e sui processi della riproduzione.

II valore in percentuale degli elementi corpuscolati rispetto al plasma è definito «emato­crito» I vari elementi costituenti la serie bianca sono in numero di 5-8000/mmc, e la percentua­le dei vari costituenti è definita forma leucocitaria. Nella tabella è riportata solamente la formula dell'adulto.

Il numero delle piastrine varia da 150.000 a 350.000.

La determinazione quantitativa degli eleménti corpuscolati del sangue può essere esegui­ta sia al microscopio, utilizzando la camera di Burker o di Thoma, sia automaticamente per mezzo dei moderni apparecchi contaglobuli.

IL PRELIEVO DI SANGUE

II prelievo di sangue può essere effettuato sia sull'uomo che sull'animale da esperimen­to. Condizione necessaria è che si operi su soggetto vivente, in quanto il sangue coagula immediatamente dopo la morte.

Questa particolarità aveva tratto in inganno i vecchi Anatomici, i quali pensavano che le arterie fossero deputate al trasporto dell'aria. Nel cadavere infatti, esse sono vuote, e la tonaca muscolare di cui sono provviste rende il lume beante, facendole assomigliare ap­punto a tubi di diverso calibro.

Prelievo sull'animale da esperimento

Si può eseguire con due metodiche differenti: 1) tagliando l'estremità della coda e racco­gliendo il sangue fuoriuscito in un idoneo recipiente o 2) pungendo con una siringa diretta­mente le cavità ventricolari del cuore (puntura intracardiaca).

Prelievo sull'uomo

Si procede pungendo il polpastrello di un dito della mano, raccogliendo la goccia diret­tamente su vetrino, oppure si aspira il sangue mediante prelievo endovenoso, da una vena dell'avambraccio. Il primo metodo è valido quando si debba eseguire lo striscio, il secon­do quando si ha necessità di disporre di una certa quantità di sangue per effettuare varie analisi (emocromo, Tests di coagulabilità etc).

In ogni caso, sia per i prelievi effettuati sull'uomo che per quelli effettuati sull'animale da esperimento, è opportuno aggiungere una sostanza antocoagulante (Eparina) e conser­vare il sangue in frigorifero se non deve essere usato immediatamente.

TECNICHE DI STUDIO DEL FEGA TO

L'unità morfo-funzionale del fegato è il lobulo epatico; esso è costituito da travate di epatociti convergenti verso la vena centrolobulare, ramo delle vene sovraepatiche. Fra le lamine adiacenti di epatociti troviamo i sinusoidi epatici da una parte (polo vascolare dell'epatocita) e i canalicoli biliari .dall'altra (polo biliare). Tra le pareti dei sinusoidi (ca­pillari intralobulari) e la membrana cellulare vi è uno spazio, del Disse, in cui sono localiz­zati le cellule del Kupffer, elementi reticolo-istiocitari a funzione fagocitaria.

La doppia polarità dell'epatocita permette l'assorbimento intracellulare di sostanze pro­venienti dal sangue che vengono metabolizzate dalla cellula e cedute ai canalicoli biliari che contengono la bile.

Il ruolo principale del fegato consiste nella regolazione del metabolismo intermedio, e le sue funzioni sono:

1) Funzione metabolica

Interviene nel metabolismo dei glicidi, lipidi e;protidi e, tramite il ciclo dell'ornitina, trasforma in urea l'ammoniaca proveniente dalla deaminazione degli aminoacidi.

2) Funzione biligenetica

L'epatocita capta al polo vascolare la bilirubina proveniente dalla degradazione dell'emoglobina, la coniuga quindi con acido glicuronico e la elimina a livello del polo bi­liare.

Nel fegato vengono prodotti gli acidi biliari, anch'essi costituenti della bile. Questi acidi (colico, litocolico e chenodesossicolico) vengono coniugati con glicina e taurina, ed hanno la funzione-di stimolare la peristalsi intestinale, di attivare la lipasi pancreatica e di per­mettere l'emulsione dei grassi a livello intestinale.

Un altro componente della bile, il colesterolo entra nell'epatocita sotto forma di estere e subisce un processo notevole di de-esterificazione.

La bile è composta da:

— acidi e pigmenti biliari (bilirubina)

— acidi grassi

— colesterolo

— lecitina, mucina e sali inorganici.

Il fegato produce incessantemente la bile, che viene immagazzinata nella colecisti. La produzione di bile varia durante la veglia (23 cc/hr) ed il sonno (15 cc/hr). Nelle 24 hr la produzione di bile si aggira mediamente intorno ai 500-1000 cc. Poiché l'organismo non ha sempre bisogno della bile, questa viene immagazzinata nella vescichetta biliare, o cole-cisti o cistifellea, che ha anche il compito di concentrarla.

3) Funzione di depurazione e disintossicazione

II fegato ha la capacità di assorbimento, biotrasformazione ed escrezione di sostanze estranee all'organismo, quali i coloranti (rosa bengala, bromosulftaleina) i farmaci e so­stanze endogene (ormoni). La proprietà di inattivare le tossine batteriche o di altra origi­ne, spiega la funzione disintossicante del fegato.

4) Sintesi proteica

Nel fegato vengono sintetizzate diverse classi di proteine: albumine, alfa e beta-globuline, transferrina, ceruloplasmina e la gran parte dei fattori del sistema dell'emostasi e dell'anti-emostasi.

5) Funzione di deposito

II fegato è un organo di riserva per molte sostanze, debitamente modificate dagli epato-citi: Ferro (sotto forma di Ferritina), glucosio (glicogeno), vitamine (B-12 ed altre).

la diagnostica di laboratorio prevede: per il fegato, an­che i seguenti esami: — Transaminasi glutamico ossalacetiche (GOT) e piruviche (GPT) Segnalano, aumentando, eventuali processi di citolisi e di necrosi degli epatociti.

— Ornitil-carbamil-transferasi (OCT) II dosaggio di questo enzima ha lo stesso significato delle transaminasi.

— Colinesterasi (CHE) La sua diminuzione indica sofferenza degli epatociti.

— Fosfatasi alcalina

È un'indagine che permette di conoscere lo «stato di salute dell'epatocita (indagini colo-statiche).

— 5'-Nucleotidasi Fa parte della famiglia delle fosfatasi. Il suo aumento depone per un'ostruzione delle vie

biliari (colostasi).

— Leucin-amino-peptidasi (LAP) È un enzima proteolitico che, come il precedente, aumenta in condizioni di colostasi.

— gamma-Glutamil-transpeptidasi (Gamma-GT)

Anch'esso viene dosato assieme ai precedenti quando si verifica colostasi intra- o extra­epatica. È molto sensibile anche a variazioni minime del flusso biliare.

— Prove di labilità serica

Questi tests (di Takata-Dohomoto, di Kunkel, di Mac Lagan, di Sia e di Wuhrmann-Wunderly) erano considerati fino a poco tempo addietro gli esami classici di «funzionalità epatica». Sono indicatori di una disprotidemia. Oggi sono praticamente in disuso.

— Antigene Australia (Au) Per la diagnosi dell'epatite virale di tipo B.

— alfa fetoproteina (AFP) È un antigene di membrana tumore-associato.

— Biopsia epatica

Viene eseguita mediante puntura transcutanea o in sede di intervento laparoscopico. Pur con diverse controindicazioni (diatesi emorragica, cisti da echinococco), è essenziale per la diagnosi di molte epatopatie.

Uno schema diagnostico per indagare lo stato funzionale epatico è il seguente: Esame dell'urina; bilirubinemia (totale e frazionata); protidemia (con elettroforesi); VES (velocità di eritrosedimentazione); fosfatasi alcalina; transaminasi (GOT e GPT); tempo

di Quick.

In casi non chiari si possono far eseguire ulteriori accertamenti.

 TECNICHE DI STUDIO DEL RENE

L'unità morfo-funzionale del rene è il nefrone, formato dal glomerulo e dal tubulo cor­rispondente.

Il glomerulo renale si forma per un'invaginazione della capsula di Bowmann, in cui prende posto la rete mirabile arteriosa che mette in comunicazione l'arteriola afferente ed efferente.

La capsula del Bowmann è formata da due foglietti, viscerale e parietale; lo spazio che li separa viene denominato «spazio di Bowmann». I sinusoidi glomerulari sono costituiti da tre strati: la membrana basale, ricca di mucopolisaccaridi, una lamina endoteliale che sporge nel lume (lamina fenestrata) ed uno strato esterno formato da cellule altamente specializzate, i podociti, che inviano prolungamenti alla membrana basale e si continuano con gli elementi del foglietto viscerale della capsula del Bowmann.

Fra le varie anse glomerulari sono disposte cellule connettivali che hanno il compito di sostenere le anse stesse. Questo apparato è definito «mesangio».

Il tubulo viene diviso in diversi segmenti che sono: tubulo contorto prossimale, ansa di Henle, tubulo contorto distale ed il tubulo collettore.

In prossimità dell'arteriola afferente si trova un addensamento cellulare, «apparato iuxtaglomerulare», che prende contatto con la «macula densa», una parte del tubulo con­torto distale.

La funzione fondamentale del rene è quella di eliminare le scorie metaboliche, mediante il meccanismo «dell'Ultrafiltrazione glomerulare» e di mantenere costante l'equilibrio idro-elettrolitico ed acido-basico dell'organismo, attraverso i processi di «Riassorbimento ed escrezione tubulari».

A livello glomerulare viene prodotta la «preurina», che diviene «urina» mediante i pro­cessi di riassorbimento ed escrezione tubulari.

Il rene, producendo sostanze quali le «Prostaglandine», la «renino», «l'eritropoietina» e la « Vitamina D superattiva», ha anche una funzione endocrina.

Esaminiamo ora la composizione dell'urina, nonché i metodi in uso per raccogliere i campioni di urina.

COMPOSIZIONE DELL'URINA

H2O   .......................... 1000-1500 cc/24 hr

Urea ................................ 20-35 g/24hr

Acido urico ......................... 0,3-0,5 g/24hr

Creatinina .......................... 0,8-1,8 g/24hr

Aminoacidi ......................... 0,1-0,3 g/24hr

Ammoniaca ........................ 0,5-0,7 g/24hr

Fruttosio, glucosio etc. .................. 0,5 g/24hr

Proteine .......................... 30-150 mg/24hr

Urobilinogeno ........................ 1-3 mg/24hr

Corpi chetonici ..................... 15-20 mg/24hr

delta-alanina ......................... 5-7 mg/24hr

Chetosteroidi ........................ 8-23 mg/24hr

Idrossicorticosteroidi ................. 2-12 mg/24hr

Nell'urina è presente inoltre K, Na, CI, Ca, P ed altri elementi.

Raccolta di campioni delle urine

Generalmente si raccolgono le urine del mattino, avendo cura di non bere almeno 12 ore prima. È consigliabile avere a disposizione urine fresche per eseguire gli esami.

Attualmente le metodiche di indagine sulle urine hanno avuto cambiamenti rivoluziona-ri, e gli esami vengono eseguiti mediante «strisce reattive» suddivise in tante zone quante sono i parametri da esaminare.

Per esame delle urine con le strisce è opportuno usare alcuni accorgimenti, quale pulire accuratamente i contenitori, immergere per brevissimo tempo (max 2"), leggere dopo 40-60". Le strisce reattive permettono di leggere: Glucosio, Proteine, pH, Urobilina, Biliru­bina, Sangue, Corpi chetonici.

La lettura delle strisce può essere fatta sia dall'operatore, confrontandola con tabelle standard, o, meglio, con fotometri muniti di stampante che evitano errori legati alla sog­gettività delle osservazioni visive.

DOSAGGI RADIOIMMUNOLOGICI (RIA)

Questa metodica di studio integra le tecniche radiochimiche e quelle immunologiche.

Il principio su cui si basa è quello della reazione antigene-anticorpo, e consente di misu­rare una vasta gamma di sostanze fino a concentrazioni dell'ordine dei nanogrammi per millitro.

Per determinare, per esempio, quantitativamente una certa sostanza nel siero, si addi­zionano al campione di siero in esame sia la sostanza marcata che l'anticerpo corrispon­dente diluito e non marcato. La radioattività legata all'anticerpo sarà tanto maggiore quanto minore è la quantità di sostanza da determinare presente nel campione di sangue in esame.

Allestimento dei sieri

Per eseguire i RIA bisogna disporre del materiale radioattivo e dell'anticerpo corrispon­dente (antisiero) non marcato. Un buon antisiero deve avere una elevata affinità per Tanti-gene, nonché una selettiva specificità ed un alto titolo anticorpale. Il «titolo» è dato dalla diluizione del siero in grado di captare il 50°7o della radioattività. Un antisiero soddisfacen­te deve avere un titolo non inferiore a 1:1000.

Sostanze marcate con isotopi radioattivi

Occorre, per queste sostanze, raggiungere il più alto grado di radioattività specifica, che è dato dal rapporto fra l'indice di decadimento dell'isotopo e la quantità in peso della so­stanza. Gli isotopi più usati sono 131-1 (proteine e polipeptidi) e 3-H per le molecole di mi­nori dimensioni. Sensibilità e specificità del metodo

La «sensibilità» viene espressa dalla quantità minima di sostanza che si riesce a determi­nare, e dipende dalla affinità dell'antisiero verso la sostanza corrispondente da determina­re.

La «specificità» viene valutata facendo reagire l'antisiero crociatamente con sostanze si­mili a quella da determinare.

Metodica

a) incubazione - in genere viene effettuata in piccoli tubi di vetro, ed il liquido di incuba­zione è formato da tampone a pH leggermente alcalino (7,8). Le condizioni necessarie per una incubazione ottimale sono:

— // tempo, che può variare da 1 a 24 hr;

— la temperatura, generalmete di 4°C. A volte questo parametro è variabile, in quan­to un campione può essere incubato per qualche minuto a 37°C oppure per diverse ore a 4° C.

b) separazione della radioattività - il metodo più semplice è quello dell'adsorbimento con immunoadsorbenti (talco, Florisil, carbone attivato etc.) della radioattività non legata. Altro sistema è quello della precipitazione degli immunocomplessi (tecniche del doppio anticorpo e della fase solida).

Altri problemi che si pongono nell'esecuzione del RIA sono la «standardizzazione» del metodo e «l'allestimento» dei campioni.

 Interpretazìone

La lettura dei RIA viene generalmente eseguita servendosi di appositi strumenti per il conteggio della radioattività presente nel campione e di appropriate curve di taratura, che possono essere realizzate graficamente o fornite da un computer opportunamente pro­grammato.

Grande importanza rivestono i controlli di specificità, anche se le industrie forniscono «kits» completi per eseguire tali dosaggi. Le principali sostanze dosabili con il metodo RIA sono:

— Ormoni (ACTH, TSH, LH, T3 e T4, Estradiolo, etc.)

— Vitamine (D3, B,2 etc.)

— Plasmaproteine (albumine, IgA, IgG, IgM, IgE, lipoproteine)

— Enzimi (pepsinogeno, chimotripsina, fruttosio-difosfatasi etc.)

— Formaci (penicillina G, digitale, barbiturici etc.)

— Antigeni tumorali (antigene carcinoembrionario, alfa fetoproteina).

Termografia

La termografia consiste nella rilevazione e misurazione delle radiazioni infrarosse emes­se dal corpo umano. La rappresentazione grafica di queste radiazioni è denominata «ter-mogramma».

Una serie di dispositivi rivelatori dell'infrarosso, posti davanti al corpo da esaminare, trasformano le radiazioni in segnali elettrici, che, opportunamente elaborati, vengono in­viati allo schermo dove si forma l'immagine.

La risoluzione massima è di 2 min e di 0,2°C. In pratica è possibile distinguere due pun­ti, distanti tra loro 2 mm, che abbiano una differenza di temperatura di -,2°C.

Le applicazioni della termografia sono numerose, in quanto molti organi cambiano le modalità di emissione di radiazioni infrarosse a seconda del loro stato funzionale. È stato anche osservato che la differenza fra il metabolismo del tessuto normale e quello del tessu­to neoplastico si esprime anche con variazioni termiche (Gerson-Cohen). I principali cam­pi di applicazione della termografia sono:

a) diagnosi del carcinoma mammario;

b) studio delle malattie vascolari;

L'esecuzione del RIA consta principalmente di due fasi: e) localizzazione della placenta;

d) patologia ossea, tiroidea e paratiroidea.

Poiché i reperti della termografia non sono specifici (in quanto le cause che possono da­re quadri termografici alterati sono diverse) è sempre conveniente eseguire in parallelo al­tre indaginiCapitolo XIX

APPUNTI DI TECNICA DI LABORATORIO

Come si trattano gli strumenti di metallo

Gli strumenti metallici (bisturi, forbici, aghi, etc.) possono arrecare danni a chi li adope­ra ed a persone vicine, per cui è necessario seguire alcune regole elementari per evitare dan­ni.

Gli strumenti appuntiti non vanno mai riposti nel taschino o nella tasca del camice, per­ché possono causare ferite involontarie.

// bisturi si impugna con la lama in basso, il pollice ed il medio afferrano saldamente il manico e l'indice viene poggiato esteso sul bordo non tagliente della lama.

Le forbici si impugnano con il pollice ed il medio, che entrano negli appositi occhielli, mentre l'indice fa da leva fermandole all'altezza della cerniera.

Gli aghi montati devono essere tenuti sempre con la punta in basso per controllarla, e vanno afferrati tra pollice ed indice sul manico di legno.

Come si conservano gli strumenti di metallo

Gli strumenti di metallo, dopo l'uso, vanno lavati in acqua calda e sapone, facendo molta attenzione a non tagliarsi durante questa operazione.

Ad evitare che possano arrugginire, vanno asciugati accuratamente con un panno di li­no, e successivamente conservati, fino al momento di usarli di nuovo, in un panno asciutto e ben pulito e riposti in un luogo sicuro.

Come si preparano le soluzioni

Per preparare le soluzioni occorre un becker da 250 cc, e vari cilindri graduati di volume variabile da 25 cc a 100 cc. È chiaro che, se bisogna ottenere quantità di soluzione superio­ri a 200 cc, il volume della vetreria adoperata sarà di conseguenza maggiore. Inoltre occor­re disporre di una bacchetta di vetro con punta arrotondata alla fiamma, oppure di un agi­tatore magnetico, per mescolare adeguatamente solvente e soluto.

Occorre distinguere due casi: soluto solido in un solvente liquido, oppure soluto e sol­vente entrambi liquidi.

Di solito il soluto è in quantità minore del solvente.

Nel primo caso, quando cioè il soluto è solido, si versa nel becker prima il soluto, indi si aggiunge lentamente il solvente misurato nel cilindro.

Nel secondo caso, invece, si versa nel becker prima il solvente, poi si aggiunge lentamen-te il soluto misurato nel cilindro.

In entrambe i casi si agita bene con la bacchetta di vetro, o con l'agitatore magnetico, fi­no a completo scioglimento del soluto nel solvente.

Per preparare una soluzione satura, che in genere è costituita da soluto solido, si versa il solvente nel becker fino a raggiungere una quantità stabilita, poi si versa lentamente il so­luto agitando bene. La soluzione è satura quando compare un precipitato non dissolvibile con l'agitazione. Se in precedenza si è pesata la quantità di soluto, pesando di nuovo la quantità non utilizzata si è in grado di stabilire quanto soluto occorre per ottenere una so­luzione satura.

Come si fa il lavaggio in acqua corrente

II pericolo che più comunemente si presenta eseguendo il lavaggio in acqua corrente è quello di perdere il pezzo, oppure quello di rovinare il preparato se il lavaggio deve essere effettuato sul vetrino. E opportuno allora procedere in questo modo:

a) lavaggio di un vetrino portaoggetto. Il rubinetto deve essere aperto in modo da avere un getto continuo ma filiforme; il vetrino deve essere afferrato saldamente ed inclinato di cir­ca 45 rispetto al getto di acqua. Il getto deve essere diretto su uno degli angoli superiori del vetrino e regolato m modo che l'acqua scorra su tutto il vetrino. Per i principianti o nel caso si debbano lavare più vetrini contemporaneamente, si usa il vaso di Schiefferdec-ker. Si immerge il vetrino tenuto saldamente con la pinza, si scuote ripetutamente e si cam­bia più volte l'acqua nel caso si voglia ottenere un lavaggio più accurato.

b) Lavaggio di pezzi. Si riempie d'acqua una bacinella più o meno capiente (a seconda del numero dei pezzi da lavare), e vi si immergono i pezzi posti in precedenza in piccoli reci­pienti chiusi con una garza (per non perdere il pezzo). Si apre il rubinetto come in prece­denza e si fa cadere continuamente l'acqua nella bacinella per il tempo necessario per il la­vaggio. L'acqua in eccedenza deborda spontaneamente.

Come si fa la dissezione pe via smussa

Scopo di questa breve nota non è quello di insegnare la dissezione per via smussa, che si esegue al tavolo anatomico sul cadavere, ma quello di permettere il corretto prelievo di un muscolo dall'animale da esperimento.

Per isolare bene e completamente il muscolo in tutto il suo decorso occorre scollarlo da­gli altri tessuti che lo mantengono aderente agli altri piani sovrastanti o sottostanti.

Dopo una piccola incisione praticata con il bisturi si usano le forbici, allargandole e chiudendole. In tal modo si allarga il taglio di partenza, si isola il muscolo con la sua fa­scia. Ci si può anche aiutare con la punta del dito indice, che viene introdotto sul piano di clivaggio, cioè di scorrimento, del muscolo che serve a ben isolare il muscolo stesso.

Come si monta in balsamo una fetta

Per conservare il preparato colorato adeso al vetrino portaoggetto è necessario coprirlocon un vetrino coprioggetto. Si tratta di un vetrino più sottile e di dimensioni molto più ri­dotte, anche se esistono, per esigenze particolari, vetrini coprioggetto delle stese dimensio­ni del portaoggetto. Il procedimento per montare in balsamo una fetta è il seguente:

a) pulire bene il vetrino coprioggetto, sciacquandolo in alcool ed asciugandolo delicata­mente con un panno di lino (è molto fragile!);

b) depositare una buona goccia di balsamo sul vetrino coprioggetto, ed appoggiare lenta­mente il vetrino portaoggetto, dopo aver fatto cadere sul coprioggetto una goccia di xilo­lo, facendo attenzione che il preparato venga compreso nell'area del coprioggetto.

Come si evita la formazione di bolle d'aria nei preparati

Ogni volta che si monta un vetrino con balsamo, è possibile che si formino bolle d'aria tra portaoggetto e coprioggetto, oppure tra preparato e coprioggetto. Poiché tali bolle rendono difficoltosa l'osservazione, è necessario evitarne la formazione.

Per evitare la formazione di bolle d'aria occorre che il vetrino sia adagiato piano sulla goccia di balsamo, e che esso scenda liberamente e senza essere forzato sul vetrino co­prioggetto. È consigliabile evitare di tenere il portaoggetto sul coprioggetto, ed è preferibi­le rovesciare il vetrino appena possibile. Bolle d'aria eventuali possono essere allontanate con uno specillo, pigiando sui bordi del vetrino coprioggetto.

Come si calzano i guanti

Per calzare i guanti accertarsi innanzitutto che siano della misura adatta, che siano ben asciutti e che siano abbondantemente cosparsi di talco nella faccia interna, quella che deve andare in contatto con le mani.

Dopo essersi lavato e ben asciugato le mani, allontanando ogni traccia di umidità, co­spargersi dappertutto le mani con talco. Quindi, mentre una persona tiene ben saldo il guanto con il bordo superiore rimboccato, si allarga l'apertura del guanto con indice e me­dio della mano dell'altro dito, mentre la mano libera scivolerà liberamente e celermente nel guanto stesso.

Come si conservano i guanti

Dopo l'uso i guanti di gomma vanno ben puliti con acqua calda e sapone, ed accurata­mente asciugati con un panno di lino asciutto. I guanti debbono essere asciugati sia ester­namente che internamente, avendo cura di allontanare ogni traccia di umidità. Per asciu­garli internamente, naturalmente, si rivoltano da dentro a fuori (come per i calzini).

Dopo di ciò, i guanti vanno cosparsi di talco sia sulla faccia interna che su quella ester­na. Per mettere il talco internamente, soffiare un poco come se fosse un palloncino, ed agitare il talco previamente depositato all'interno. Alla fine i guanti vanno riposti in un contenitore (scatola di cartone o panno asciutto e pulito) in un luogo asciutto. Come si fa una osservazione

L'osservazione è l'ultima parte dell'esperimento, quella che distinguerà il medico dal tecnico, e pertanto è la fase che deve essere seguita con la maggiore accuratezza e disponi­bilità.

L'accuratezza di una osservazione è direttamente proporzionale alla capacità critica dell'osservatore, cioè alla sua intelligenza ed alla sua preparazione culturale.

Si presume che qualsiasi studente di medicina abbia la capacità di condurre una accura­ta osservazione, e perciò per fare una buona osservazione occorre solo pazienza e buona volontà.

L'osservazione va accuratamente, dettagliatamente e lungamente descritta su una sche­da o su un quaderno personale, che rimane l'unico strumento per poter fare una discussio­ne critica sul preparato osservato. È il caso di soffermarsi a descrivere con estrema preci­sione tutto ciò che si osserva attraverso il microscopio, aiutandosi eventualmente con sche­mi, disegni etc.

Come si compila la scheda da esperimento

La scheda da esperimento è l'unico documento che permette di stabilire se un esperi­mento è stato ben condotto o meno, e permette inoltre di individuare eventuali errori che non hanno portato ad un risultato eccellente.

Pertanto la scheda va compilata con estrema precisione prendendo nota di tutti i tempi, tutti i passaggi, le eventuali difficoltà incontrate, le eventuali variazioni apportate e gli eventuali errori.

Bisogna descrivere con estremo rigore ed estremo dettaglio tutto ciò che si è fatto dall'inizio alla fine dell'esperimento, segnando anche i tempi impiegati per ciascun passag­gio. La scheda può essere anche corredata da grafici e disegni, che permettono di fissare alcuni punti dell'esperimento.

Come si prepara una etichetta

È preferibile usare etichette bianche autoadesive, delle dimensioni di cm 1,5 x 1. Sull'eti­chetta si scrive con una matita nera, non con la penna o il pennarello, il numero dell'espe­rimento, la data di inizio e finale, il tipo di materiale ed infine il tipo di colorazione.

L'etichetta si attacca sul contenitore o sul vetrino, e si ricopre con scotch per evitare che possa bagnarsi o scolorirsi.

Come si misura il livello di un liquido in un cilindro graduato

Quando si versa un liquido in un cilindro graduato si forma il cosiddetto menisco. Il li­vello superiore del liquido, cioè, non risulta in piano, ma a concavità superiore.

La lettura pertanto va effettuata con il cilindro fermo su un piano, non tenere il cilindro in mano. L'occhio dell'osservatore deve abbassarsi al livello del menisco, e la lettura vafatta nella parte piana, cioè al centro del liquido e non sui bordi laterali.

Come si usa la pipetta

La pipetta graduata va tenuta con la punta in basso, impugnata verso la parte superiore tra pollice e medio, in modo che l'indice serva a chiudere il foro superiore.

Si aspira con la bocca la soluzione (o il liquido) da misurare, facendo attenzione a non succhiare la soluzione. È sufficiente aspirare una quantità poco superiore a quella da mi­surare.

Con l'indice si tiene ben chiuso il foro superiore per non far ricadere tutta la soluzione, si versano nel contenitore alcune gocce di liquido fino a raggiungere la misura prefissata ed il tutto viene versato nell'apposito contenitore.

Come si lava e si conserva la vetreria

La vetreria si lava dapprima con acqua tiepida e detersivo, si sciacqua quindi con acqua distillata, e si mette a scolare e ad asciugare su un foglio di carta bibula o negli appositi scolavetreria.

Per lavare bene all'interno cilindri e vetreria con il collo stretto (beute, bottiglie etc.) è bene usare uno spazzolino puliscitubi.

Le pipette vanno lavate sotto abbondante acqua corrente e poi con acqua distillata in appositi recipienti cilindrici. È bene disporre le pipette con l'apertura più larga rivolta in­feriormente.

Una volta ben asciugata, la vetreria va conservata al riparo della polvere in un luogo si­curo dove non possa rompersi.

Il lavaggio della plastica segue le stesse modalità della vetreria, solo che questa va con­servata asciutta al riparo della polvere e lontana dal calore.

Come si fa la dissociazione mediante aghi

II materiale da dissociare si mette in una capsula di Petri, immerso in poca soluzione fi­siologica.

La capsula si poggia su un tavolino, e l'operatore deve essere comodamente seduto con gli aghi montati impugnati saldamente. I due aghi vanno tenuti tra pollice, indice e medio, come una comune penna da scrivere.

Lavorando con entrambe gli aghi si procede alla dissociazione, ed uno degli aghi, alter­nativamente, può servire per tenere fermo il pezzo mentre l'altro serve per dissociare.

Come si misura il pH mediante cartine

Le cartine per misurare il pH variano di colore a seconda del pH della soluzione. Sulla confezione vi è una scala cromatica di riferimento, per cui ad un determinato colore corri-sponde un determinato pH.

Pertanto, si immerge l'estremità libera della cartina nella soluzione, e la si strappa dal mazzetto senza toccare con le mani l'estremità libera.

La cartina non si deve bagnare troppo, pertanto va immersa per 3 o 4 mm e rapidamen­te, si attendono almeno 30" e si confronta il colore con la scala cromatica della confezio­ne.

Come si prepara acqua acida, basica e tamponata

L'acqua distillata dovrebbe essere neutra, ma in realtà è sempre acida, con pH che varia da 5,4 a 6,5.

L'acqua di fonte dovrebbe essere neutra, ma in realtà è sempre basica, con pH 7,4 - 7,6.

Pertanto, per preparare acqua cosiddetta tamponata, cioè a pH 7, si fa una miscela'di acqua di fonte e di acqua distillata in parti uguali.

Per preparare acqua acida si mettono alcune gocce di una soluzione di HC1 IN in 100 cc di H2O e si agita bene, controllando in seguito il pH.

Per preparare acqua basica si mettono alcune gocce di una soluzione IN di NaOH in 100 cc di H2O, si agita bene e si controlla il pH.

Come si puliscono i vetrini portaoggetto e coprioggetto

I vetrini portaoggetto non sono fragili e si strofinano con un panno di lino o di lana pu­lito e ben asciutto. Se sono molto sporchi possono essere sciacquati con acqua distillata o con alcool. L'immersione in alcool può anche essere eseguita dopo la pulitura con il pan­no, ed i vetrini vanno poi lasciati asciugare su un foglio di carta bibula.

I vetrini coprioggetto sono invece di una estrema fragilità, per cui è opportuno tenerli delicatamente tra pollice ed indice usando le dita come una pinza ed afferrando il vetrino sui lati opposti. Si puliscono quindi con un panno asciutto e ben pulito, facendo attenzio­ne a non forzare troppo per non rompere il vetrino.

Come si calcola un deficit idrico

La valutazione del deficit del contenuto idrico dell'organismo deve tener presente la concentrazione normale del Na e dell'H2O, ed inoltre deve basarsi sul presupposto che il sodio si comporti come se fosse presente in maniera uniforme nell'acqua corporea totale

I valori normali di acqua e sodio, rispettivamente, sono-140mEq/l 60% del peso corporeo

II deficit idrico non si può calcolare in base alla percentuale di H2O per ovvi motivi per cui si preferisce stabilirlo in base alla concentrazione di Na. Esempio:

Un uomo di 70 Kg di peso corporeo ha la natriemia (Na nel sangue) di 150 mEq/1 Quale sarà il suo deficit idrico? I calcoli da eseguire sono i seguenti:

Contenuto normale in H2O = 70 x 60 = 42 1

100 Natriemia normale = 42 1 x 140 mEq/1 = 5.880 mEq

Si tenga presente che il contenuto in sodio deve rimanere costante, per cui un aumento della sua concentrazione nel sangue indica una diminuzione del contenuto idrico. Essendo la natriemia, nel nostro caso, passata da 140 mEq/1 a 150 mEq/1, avremo: 5.880 mEq = 150 mEq/1; per cui x  = 39,2 1

x (1) sottraendo questo valore al contenuto idrico del soggetto m esame avremo che  le perdite idriche assommano a litri:  42 — 39,2 = 2,8.